免疫沉淀技术

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1、免疫沉淀技术技术简介：蛋白质作为生命形态中最重要的分子，一直以来都是全球科学家们研究的焦点。免疫沉淀技术是以抗体与抗原间的专一性为基础用于研究蛋白质相互作用的经典方法，也是确定两种蛋白质在细胞内相互性生理作用的有效方法。表现为可溶性抗原与相应抗体在液相或凝胶中特异性结合后，形成的免疫复合物在一定条件下出现蛋白质析出。免疫沉淀与凝集反应、中和反应、补体参与的抗原抗体反应并称经典免疫学技术。随着对蛋白质研究的不断深入，人们将免疫沉淀方法与其他方法相结合，在其基础上衍生出很多更为复杂的技术，使蛋白质分析方法更为多样化，应用范围更为广泛。该技术现已广泛应用于基

2、因、蛋白质以及其相互作用等研究领域。免疫沉淀技术的发展：免疫沉淀技术的基本策略就是利用抗体与相应抗原的高亲和力特性检出和结合溶液中靶分子。免疫沉淀技术从诞生起就一直随着科技的发展而进步。早期，研究人员利用凝胶电泳分辨免疫沉淀蛋白，将抗原溶液加入琼脂糖之类的可渗透基质的小孔内，并在邻近孔内加入抗血清，随着抗原抗体扩散，大分子进入凝胶内，两者相互作用，形成由多个抗体分子与抗原桥联组成的复合物，通过抗体和抗原的扩散形成浓度梯度，并在最适浓度处形成多分子网络复合物，最终大分子蛋白复合物从溶液中析出形成肉眼可见的沉淀线。免疫沉淀的早期改进方向是促进多聚体反应，使

3、免疫复合物从溶液中析出。随后，研究人员发现利用第二抗体与免疫复合物中的抗体形成网络结构，可以不必对每种抗原的第一抗体进行滴定实验，这种方法一直沿用至今。20世纪70年代中期，人们开始采用固相反应，利用固定在金黄色葡萄球菌表面的蛋白A吸附抗体，再与相应抗原结合。随着科技的发展，目前这种方法已改进为利用表面固定了蛋白A或蛋白G的微球来分离抗原抗体复合物，以达到检测抗原或目标蛋白的目的。免疫沉淀技术的分类：随着对蛋白质研究的不断深入，人们将免疫沉淀方法与其他方法相结合，在其基础上衍生出很多更为复杂的技术，使蛋白质分析方法更为多样化，应用范围更为广泛。该技术现

4、已广泛应用于基因、蛋白质以其相互作用等研究领域。按应用范围分类，可分为以下四类：1)免疫沉淀（Individualproteinimmunoprecipitation,IP）：利用抗体特异性从细胞裂解物或其他可溶性生物样品中纯化已知特定蛋白质。IP与SDS-PAGE方法联用时，可达到测量蛋白质相对分子量，对已知抗原定量，确定蛋白质降解速率等目的。2)免疫共沉淀（Proteincompleximmunoprecipitation,Co-IP）：利用抗体沉淀相应特定抗原，同时沉淀与该抗原相互结合的其他分子，主要用于研究蛋白质相互作用。Co-IP与WB或质谱

5、方法结合，可用于确定特定蛋白-兴趣蛋白在天然状态下的结合情况，确定特定蛋白质的新作用搭档。3)染色质免疫沉淀（Chromatinimmunoprecipitation,ChIP）：在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断，通过免疫沉淀复合体特异性富集目的蛋白结合的DNA片段，再通过对DNA片段的纯化和检测，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可用于研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达间的关系。将ChIP与基因芯片相结合形成的ChIP-on-chip方法，可用于特定反式因子靶基因的高通量筛选

6、；ChIP与体内足迹法相结合，可用于寻找反式因子的体内结合位点。4)RNA免疫沉淀（RNAimmunoprecipitation,RIP）：其原理与ChIP相近，但RNA免疫沉淀是用来研究与蛋白质结合的RNA在基因表达调控中的作用。免疫沉淀的关键影响因素：每种免疫沉淀方法都有一套固定的操作程序，但都是以抗原-抗体特异性结合为基础。目前常规操作是利用共价结合蛋白A或蛋白G的琼脂糖或磁性微球将反应后的抗原-抗体复合物富集纯化。蛋白A和蛋白G能特异地和抗体的保守区Fc段结合，形成稳定的抗原-抗体复合物附着在微球上（示意图见图2），溶液内无关的分子可以通过洗涤

7、微球被清除，最后，再采用一系列方法分析纯化抗原或与抗原结合的其他分子。整个过程中值得注意的几个关键影响因素如下：1)样品处理的质量免疫沉淀实验成功的关键在于第一步样品处理。免疫沉淀实验本质是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中抗原的质量，如抗原的丰度及抗原的构象状态。样品处理应根据抗原样品的来源如组织样品、细胞或其他形式的样品，选择适当的方式进行细胞或组织破碎，使待检抗原释放至样品溶液中。裂解缓冲液的使用应注意添加合适的蛋白酶抑制，避免抗原或抗原-其他分子复合物被降解，另外，应选用去垢剂强度合适的裂解液，既保证有

8、效裂解细胞释放抗原又不破坏蛋白质之间的相互作用。2)抗体的选择在考虑抗体特异性的同时，还需考虑