组织染色质免疫沉淀技术(chip)-步骤.doc

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1、Chip步骤组织裂解：1.新鲜组织。切成1-3mm3小块。2.转移组织到50ML试管里。加入10mlof1XPBS.3.加甲醛至终浓度为1%。室温下转动15—20mins。（10ul）4.加2.5MGlycine至终浓度为0.125M(终止交联)。4°C下转动10mins。（0.5ml）5.100g,4°C离心样本5mins。6.弃上清，取沉淀。用45ml冰冻1XPBS和25ml冰冻1XPBS各洗一次。离心弃上清。7.再加入2ml冰冻1XPBS。匀浆机裂解组织。1000rpm，4°C，离心5min。弃上清。8.细胞裂解液重悬细胞。加入蛋白酶抑制剂PMSF(10ulperml),

2、aprotinin(1ulperml)andleupeptin(1ulperml). 冰上孵育10-15mins9.5,000rpm，4°C离心5分钟。取沉淀10.细胞核裂解液重悬细胞加入（8）中的蛋白酶抑制剂。冰上孵育10-20mins。11.接下来就进去超声过程了。（接下来第一天的5）第一天1.细胞中加入1%的甲醛，8ml的培养液加入216 ul的甲醛，37度十分钟。2.配制含有蛋白酶抑制剂的PBS20ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml3.将细胞拿出来，迅速的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。胰酶消化20秒，加入含蛋白酶抑制剂的PBS1ml。用细胞

3、刮刀把细胞刮下，收集到1.5ml的离心管里面。4.4度2000rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。吹打重悬细胞，冰上孵育１０分钟。5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一个新的2ml的离心管，弃沉淀。7.稀释超声后的上清液到10X的CHIP稀释液，200ul的上清液加入1.8ml的CHIP稀释液，达到最终体积2ml。8.为去除非特异性，加入75ul的SalmonSpermDNA/ProteinAAgarose-50%Slurry，4度旋转30分钟

4、。9.1000rpm离心3min沉淀SalmonSpermDNA/ProteinAAgarose-50%Slurry，收集上清液。10.上清液加入1抗，4度振荡过夜。（5—10大概一个小时）第二天（1—8大概两个半小时）1.加60ul的SalmonSpermDNA/ProteinAAgarose-50%Slurry，沉淀抗体/抗原复合物，4度旋转一小时。2.1000rpm4度3min收集沉底，移除上清液，开始洗脱过程。3.低盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀4.高盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀5.Licl免

5、疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀6.TEBuffer，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀，两次7.现在得到的是proteinA/antibody/histone/DNAcomplex，新制备elutionbuffer(1%SDS,0.1MNaHCO3)。加250ulelutionbuffer到沉淀，混匀后室温旋转15min。1000rpm离心3min沉淀，移上清液到新的离心管，重复上面的过程，最后上清液体积大约500ul。8.加入20ul的5M的nacl反转交联，65度过夜。第三天（大概3个小时）1.加10µl的0.5MEDTA,2

6、0µl的1MTris-HCl,pH6.5和2µl的10mg/ml的ProteinaseK到液体。45度旋转一小时。2.加入等体积的苯酚/氯仿抽提ＤＮＡ，５０００g离心10min，收集上清液，不要吸到丝状蛋白。3.加入2.5倍的纯乙醇和1/10体积的乙酸钠，沉淀ＤＮＡ，５０００g离心10min，收集沉淀，用７０%的酒精洗涤，开盖晾干。4.用10ul的TE缓冲液溶解。测浓度。5.开机预热半个小时，加入200ml的TE缓冲液调零,倒掉。加入198ml的TE缓冲液和2ml的样本，测260nm的吸光度。得出值是ug/ul6.PCR体系的配置样本DNA1ul上游引物2ul下游引物2ul10

7、xEasytapbuffer5ul100mMMgSO41ulEasyTaqDNAPolymerase0.5ul加去离子水34.5ul总体积50ulPCR循环94度5分钟解链94度30秒退火57度30秒延伸72度1分钟循环解链，退火，延伸。35个循环72度10分钟琼脂糖凝胶鉴定1．配制2.5%的琼脂糖凝胶：称取0.5克琼脂糖粉末加入20ml的液体中。微波炉加热一分钟，冷却5分钟以上，冷却后加入eb，摇匀，倒入制胶模板中，十分钟以后凝固。2．凝固后将其取出，放入电泳槽中，加样孔在负极端。样本与6