《DNA分子的克隆》PPT课件

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1、第四章DNA分子克隆基因克隆方案重组子的筛选目的基因片段的获得体外重组P102重组DNA导入受体细胞扩增或表达克隆路线p100第一节重组体导入受体细胞P109接合转化噬菌体转染噬菌体转导CaCl2转化法（化学方法）高压电穿孔法转化显微注射法转化基因枪法转化常用方法：生物转化法物理转化法转化(transformation)：感受态的大肠杆菌捕获和表达质粒DNA的过程。转染(transfection)：感受态大肠杆菌捕获和表达噬菌体DNA的过程。转导(transduction)：噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。生

2、物转化法一、CaCl2转化法感受态细胞(Competentcells):受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为最适摄取和容纳外源DNA的生理状态。目的：增加受体菌细胞膜的通透性。CaCl2转化法基本原理1970年建立此技术，Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）0℃低渗的CaCl2处理使大肠杆菌进入“感受态”（膜磷脂在低温下形成液晶结构，细胞吸水膨胀)，外源DNA与Ca2+形成复合物粘附在表面，而热休克使内外膜温度不平衡，细胞膜出现空隙，这样DNA得以进入细胞，然后进行转化

3、子的筛选。CaCl2转化法要点：1.培养对数生长期细菌：OD600=0.4-0.5；2.冰浴0℃CaCl2处理；3.获得感受态细胞：收集菌体、用冰冷的CaCl2悬浮、分装细胞。低温保存12-24小时。4.42℃热休克处理1-2min；5.恢复培养：加入无抗生素培养液37℃培养1h6.筛选转化子：用含抗生素的培养基培养10h。二、电击法（electroporation）or电穿孔法基本原理：将待转化的重组质粒加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加短时高压电场，细胞壁和细胞膜产生缝隙，在细胞膜双脂层上形成瞬时微孔，重组质粒DN

4、A可进入细胞。优点：操作简单，但转化效率差别很大。材料、电压、时间、温度均影响转化效率。要求DNA大小无限制、宿主细胞广泛。控制好电压和电击时间，否则会对细胞造成不可逆的击穿。电穿孔转化仪三、显微注射法（microinjection）使用极细的毛细管在显微镜下将目的DNA注射到动物细胞或植物原生质体的一种直接方法。直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。优点：可操作性强，转化率高。缺点：需有相当精密的显微操作设备，操作繁琐四、基因枪法（genegun）-微弹轰击法（particle-bombardment

5、）将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒（0.6-1um）表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞整合到染色体上并表达，实现基因的转化。费用高：250毫克金粉4300元，1克钨粉250元不受材料限制；但多拷贝插入chr。重组子（recombinant）：含有重组DNA分子的转化子。第二节重组体克隆的筛选和鉴定转化子（transformant）：将导入重组载体分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。转化子：载体自连、载体与多个DNA相连、多拷贝外源DNA相连接、单拷贝DNA与载体连接一、表

6、型特征筛选1、利用抗生素的插入失活筛选转化子不同抗性遗传标记的使用：1、Ampr：表达产生β-内酰胺酶，降解Amp，使用浓度：30-50ng/ml2、tetr：编码改变细菌膜的蛋白，阻止Tet进入细胞，使用浓度：12.5-15.0ug/ml3、Cmpr:cat基因转译氯霉素乙酰转移酶（CAT），使Cm乙酰化而失效，终浓度：30ug/ml4、Knr：编码修饰卡那的酶，阻止kn对核糖体的干扰，终浓度：5ug/ml2、lacZ’基因插入失活α-互补菌落蓝白选择IPTG、x-gal菌落蓝白选择3、插入表达筛选法：外源基因插入后

7、激活标记基因表达，据标记基因的表达产物进行筛选。标记基因上游存在负调控序列：如CI基因在terr上游，抑制terr基因表达，DNA插入CI内，CI基因失活，terr表达。4、噬菌斑筛选法：λ噬菌体DNA包装长度：36-51kb转化子：裂解宿主清形成晰噬菌斑非转化子：正常生长无噬菌斑插入型载体（37kb）：lacZ’筛选替换型载体（26kb）：清晰噬菌斑是重组子二、根据插入基因的表型选择利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。1.弥补缺陷his-his+受体菌：外源基因：重组子能在不含组氨酸的培养

8、基中生长转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含DHFR的克隆才能生长使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状三、菌落原位杂交法（insituhybridization）筛选基因组