《分子克隆》PPT课件

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1、基因工程GeneticEngineering李黄金Email:lihuangjin@sohu.com生命科学与生物制药学院２００9基因工程课程内容523416789基因工程概论分子克隆单元操作大肠杆菌基因工程非肠道细菌基因工程真菌基因工程昆虫基因工程高等动物基因工程高等植物基因工程蛋白质工程、途径工程基因工程的操作过程切接转增检第二章分子克隆单元操作2.22.32.1克隆载体DNA的体外重组（切与接）目的基因的克隆2.4转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.52.5基因文库与目的基因的克隆基因工程的三大用途与三大要素？目的基因的克隆战略：1、

2、构建感兴趣的生物个体的基因文库将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆2、利用PCR扩增技术或化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。2.5基因文库与目的基因的克隆DPCR法CcDNA法B鸟枪法E化学合成法A基因文库的构建A基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序2.5基因文库与目的基因的克隆基因组（Genome）：含有一个生物体生长、发育、繁殖和活动所需要的全部遗传信息的整套核酸。病毒/噬菌体：单链/双联、DNA/RNA原核：染色体DNA和质粒DNA真核：染色体D

3、NA、线粒体DNA、质体DNA环境样品中的细菌和真菌的基因组总和，包含了可培养的和不可培养的微生物的基因。宏基因组（Metagenome）：基因文库的基本概念基因库与基因文库基因库（genepool）特定生物体全基因组的集合（天然存在）基因文库（genelibraryorgenebank）包含特定生物个体或特定环境样品全部基因的克隆集合（人工构建）。基因组文库（含有全部基因）根据构建方法的不同，基因文库分为：cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）基因文库的基本概念基因文库构建的基本策略用鸟枪法构建基因组文库或宏基因组文库，材料来自染色体DNA用cDNA法

4、构建cDNA文库，材料来自mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库基因文库的基本概念基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小例如，人的单倍体DNA总长为2

5、.9x109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆基因文库的基本概念基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选基因文库的构建程序基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文

6、库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高AAAA用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100kb左右如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000kb大小的DNA片段基因文库的构建程序基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区第二，保证DNA片段大小均一超声波处理后的DNA片段呈平

7、头末端，需加装人工接头部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！基因文库的构建程序载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体l-DNA由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒上述几种载体的最大装载量如下：质粒考斯质粒10kb25kb45k

8、bBAC300kbYAC400kb用于