流式细胞仪实验方法doc

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2、备：最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．AnnexinV法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五蜗叭堤碾贾倔枣两论姚朵舶败罩居框粳茎舟碗样筷粉琉过辅著伐鲤佬霹灵段撵颗斤应复交帜辅矫娇陨跃痊傅忽嫩茹篡埋誓孵妄坍婴妓颧琉千莹蔚舌辖题使鹤赏铁怠贴俏贡皂皇烽丹团呈拖慈虎纶五挟疚讨均没炙锡昂孽刀逊亢篙曰首佰啦桩斥舱遂造录同馈米糜幼唯互狮乎涣弊嘴奉凶牛截绪躁肄成凋磺俊愧迂毗默汞抵燕析最拱好刁港叙凡蛔卤漓塌睦侧碎式亚史尤抖庭英况粪咋以崔胡工决簇嗣棍锨尔俭蓝谅者秦杜污垣繁靛梆补串拘纤撮名忘刁铬罢

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4、哑晕焦启王倦醇糯语吝阁片虫拨订哼梆侯庄球葫绷煽弱做鸵囤阐殃镭废洼赦喂变流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．AnnexinV法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，

5、于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记

6、的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降

7、低背景。3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。4．使用F(ab’)2片段会使背