Western Blotting(半干转) 超级详细步骤

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1、WesternBlottingAnalysisGuide（半干转）Westernblotting(半干转)可分为以下9个步骤：一、蛋白的提取A．总蛋白提取1.将收集的细胞或组织(约0.1g)从-80°C冰箱取出，按1:10(w:v)加入冰浴的蛋白裂解液(RIPA)；并加入1/10体积的蛋白酶抑制剂（PMSF）2.用Dounce手动匀浆器或电动匀浆器，匀浆细胞或组织（注意：全程冰上操作，每个样品用Dounce上下抽动相同的次数，电动匀浆器匀浆相同的转速及时间）3.冰上静置20min后，12000rpm离心，4°C，15min，取上清。B．核蛋白提取1.称取100mg肝脏

2、冰冻组织置于Dounce手动匀浆器，加入1mL冰浴的核蛋白裂解液A，上下抽动5下（注意：全程冰上操作，不同组织上下抽动需摸条件，匀浆后能看到些许小组织块）2.将匀浆液倒入1.5mL离心管，瞬时离心30s3.上清倒入另一1.5mL离心管，冰浴5min4.3000rpm离心，4°C，10min，上清倒入另一1.5mL离心管收集（此为胞浆蛋白）5.沉淀加入50μL核蛋白裂解液B吹打，冰浴20min6.12000rpm离心，4°C，20min，将上清吸入0.5mL离心管收集（此为核蛋白）。二、蛋白浓度的测定2+++在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu还原为Cu，一

3、个Cu螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。1．BCA标准品和样品的准备：（BCA标准品为5mg/mL）配制1mg/mL的标准品：取10μL原标准品+40μLPBS缓冲液混匀，浓度为1mg/mL配制0.25mg/mL的标准品：取5μL上述1mg/mL的标准品+15μLPBS缓冲液混匀，浓度为0.25mg/mL样品用水以1–5倍稀释，并且将蛋白裂解液用PBS缓冲液按相同的比例稀释作为样品的空白对照（建议样品稀释2倍，不同组织使用不同稀释倍数）。2．配制工作液：根据标准品和样品数量，按试剂A:B=50:1配制适量BCA

4、工作液，充分混匀（注意：BCA1工作液室温24h内稳定）。3．标曲制作与样品测定：按下表比例加入96孔蛋白测定板：0.25mg/mL的标准品1mg/mL的标准品终浓度031.2562.51252505001000试剂/编号①②③④⑤⑥⑦BCA标准品，μL02.552.551020PBS，μL2017.51517.515100工作液，μL200200200200200200200样品测定：2μL样品+18μLPBS缓冲液+200μL工作液（可做3个重复）；蛋白裂解液用水按相同的比例稀释作为样品的空白对照37°C孵育30min，酶标仪OD595nm测定吸光度；根据标曲和样

5、品吸光度计算出样品相应的蛋白浓度；将蛋白统一用蛋白裂解液稀释至合适的浓度（注意：蛋白冰上操作），-80°C冰箱存放（但存放不久，按蛋白上样比例加入1×loadingbuffer，再95℃变性5min，-80°C保存，会比较久）。三、样品的前处理蛋白变性是破环蛋白的三级结构，使抗体识别的抗原表位暴露出来。SDS作用：结合蛋白可以使蛋白表面带满负电荷，使电泳可以顺利进行。因此，SDS的质量非常重要，需要新鲜的。DTT作用：强变性剂，减少蛋白二硫键。甘油：助沉剂，使蛋白能维持在胶孔上方。上样体系准备：V样品:V1×loadingbuffer=3:1，振荡混匀离心后，95-1

6、00°C水浴5min，若是跨膜蛋白70°C水浴5-10min，变性前后都需要震荡混匀（4×loadingbuffer用PBS液稀释至1×，可适当增加1×的浓度，方便上样，但不可太大）注意：如果是做蛋白质相互作用，需做变性胶，参照如下:ProteinStateGelconditionLoadingbufferMigrationbufferReduced-DenaturedReducing&DenaturingWithβ-mercaptoethanolWithSDSorDTTandSDSReduced-NativeReducing&Non-DenaturingWithβ-

7、mercaptoethanolNoSDSorDTT,noSDSOxidized-DenaturedNon-Reducing&DenaturingNoβ-mercaptoethanolWithSDSorDTT,withSDS2Oxidized-NativeNon-reducing&NativeNoβ-mercaptoethanolNoSDSorDTT,noSDS四、SDS-PAGE电泳1.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。2.配胶配方参照附。该过程戴手套，TEMED等具