《发酵大题范围》PPT课件

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1、参数检测例：鸟苷生产在鸟苷发酵中，发现发酵到40小时后鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖,使发酵过程pH下降，补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？于是进行以下一些测定与分析什么因素导致pH下降？1、有机酸的积累有机酸积累pH下降补加氨水在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的[NH4+]积累，相应出现产苷速率下降。——代谢不正常测定以下中间物发酵后期

2、丙酮酸积累2、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步通过HPLC测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸和[NH4+]积累。氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在8小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在48小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的12.6倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变

3、化可能是导致代谢流迁移所致。3、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于EMP途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（GS）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。恶性循环激活磷酸果糖激酶丙酮酸积累氨水补加增加[NH4+]积累抑制GS抑制TCA循环丙酮酸积累EMP流量增加丙氨酸积累（二）代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖酵解途径（EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和

4、丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的时序分析12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以PFK的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到40小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，PFK相对酶活增加，这表明此时通过EMP途径的糖代谢通量已有了明显的增加。丙酮酸激酶时序分析丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在24小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮

5、酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素磷酸戊糖途径（HMP）关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6－磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化6－磷酸葡萄糖脱氢生成6－磷酸葡萄糖酸内酯。6－磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期6－磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持EMP和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到40小时后，6－磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的

6、进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在HMP途径通量下降而EMP途径通量增加。三羧酸(TCA)循环的关键酶三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。柠檬酸合成酶时序分析从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水

7、平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量并没有发生明显的增加。即代谢流迁移发生在EMP和HMP之间，主要是由于EMP和HMP途径之间的分配平衡被打破所造成的。EMP途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。丙氨酸脱氢酶的时序分析在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了EMP途径代谢流

8、增加造成的代谢不平衡。结果加入EMP途径的抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量基因工程菌（三）基因不稳定性生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：分离丢失结构不稳定性宿主细胞调节突变1、分离丢失指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。为什么会出现质粒丢失呢？质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和低拷贝质粒