《实时定量PCR》课件

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1、实时定量PCR（qRT-PCR）实时定量PCR（qRT-PCR）PolymeraseChainReaction（PCR）　聚合酶链式反应伟大的天才发现！KaryB.Mullis<>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单

2、链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链PCR的基本原理PCR的基本原理模板DNA94℃50-65℃引物1引物2DNA引物72℃PCR的基本原理引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束94℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50-65℃TaqTaqTaqTaq72℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第2轮结束PCR基本原理Mg2+模板引物dNTPDNA聚合酶PCRPCR反应基本要素1、单、双链DNA，cDNA均可2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DN

3、A聚合酶抑制剂DNA结合蛋白类3、一般100ngDNA模板/100L,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加（1）模板1、引物浓度一般为0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降2、引物的设计（2）引物（3）TaqDNA聚合酶1、酶的用量一般为0.5-2.5U/50l，2、酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）Mg2+1、Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，一般用量为0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。2、Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。3、Mg2+可与负离子结

4、合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。1、dNTP浓度取决于扩增片段的长度2、四种dNTP浓度应相等3、浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量4、dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）dNTP变性使双链DNA解链为单链,94℃30-40s退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。循环参数（3）延伸68-75℃,一般为72℃延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模板DNA的浓度,一般为25-35次次数过多

5、,扩增效率降低,错误掺入率增加常用PCR反应体系(以HiFiTaq为例)模板1.0μL上游引物0.5μL下游引物0.5μL10XHiFiBuffer（+Mg2+）2.5μLdNTPs2.0μLHiFiTaq酶0.2-0.3μLddH2O补足25μL共25μL常用PCR反应条件94℃2-5min94℃30-40sTm30-45s72℃1min/1kb72℃10min12℃+∞25-35个循环几种常用PCR技术RT-PCR(ReverseTranscriptionPCR)反向PCR(ReversePCR)RACE(Rapid-AmplificationofcDNAEnd

6、s)qRT-PCR(QuantitativeRealTimePCR)基因mRNA蛋白质多肽链RT-PCR(反转录PCR)DNA水平RNA水平蛋白水平RT-PCR基本原理mRNAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTReverseTranscriptionmRNAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTcDNART-PCR一般步骤1、RNA提取RNA质量的检测一般RT-PCR要求提取的RNA要有较高的完整性和纯度完整性检测（1%琼脂糖胶电泳）纯度检测（OD260/280）OD260/280一般介于1.9-2.1之间，小于1.9时蛋白污染；大于2.1时

7、RNA发生降解28S18S5S2、反转录RT-PCR一般步骤在冰盒上加入以下试剂：组成体积随机引物或OligodT）1μL1-5μgTotalRNAxμLDEPC-TreatedH2OyμL体系配制完成后瞬时离心，70℃反应5min,然后迅速转移至冰盒，冰浴2-5min,此步骤的作用是去除mRNA的二级结构。RT-PCR一般步骤组成体积5XBuffer4μLdNTPs1μLRNAseinhibitor1μLM-MLV1μLDEPC-TreatedH2OxμL1、混匀，42℃，90min2、70℃，10min，终止反应3、A3检测在冰盒上加入以下试剂：反向PCR(