实时荧光定量pcr原理课件

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1、实时荧光定量PCR主讲人：廖旭东PCR定义PCR简称聚合酶链式反应。聚合酶链式反应，是指在体外，酶促合成特异性DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火和适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时的特点。DNA聚合酶以单链DNA为模板，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。PCR反应条件PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引

2、物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。温度与时间的具体分析①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。温度与时间的具体分析②退火(复性)温度与时间：退火温度是影

3、响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度。温度与时间的具体分析对于20个核苷酸，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。复性温度=解链温度-(5～10℃)在解链温度允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。温度与时间的具体分析③延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：7

4、0～80℃150核苷酸/S/酶分子70℃60核苷酸/S/酶分子55℃24核苷酸/S/酶分子高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。温度与时间的具体分析PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1-2min是足够的。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。1234522557294时间（m

5、in）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。如何检测荧光强度呢,我们先来了解一下荧光探针。荧光共振能量转移要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念我们需要首先明确，那就是荧光共振能量转移(FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体和能量受体对,其中供体的发射光谱

6、与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1—10nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。所以我们就检测不到它的荧光。TaqMan---水解型探针5′端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等，即供体。3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光（荧光共振能量转移原理，FRET）Taq酶可水解探针工作原理在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶以引物为起点沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链。每扩增一条DN

7、A分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中检测荧光.那我们如何对起始模板进行定量呢？接触过PCR的同学与同事知道我们是通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析的。我们现在先搞懂三个概念：什么叫扩增曲线、荧光阈值、Ct值？实时荧光定量PCR原理1、扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团2、荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：荧光阈值