《微生物基因工程》PPT课件

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1、D基因工程菌的遗传不稳定性及其对策8大肠杆菌基因工程C大肠杆菌基因工程菌的构建策略B外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征E利用重组大肠杆菌生产人胰岛素A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征8大肠杆菌基因工程大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物A大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征8大肠杆菌基因工程大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系

2、统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素B外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理8大肠杆菌基因工程启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数启动子启动子最佳距离的探测目的基因EEAEE启动子A酶切开Bal31酶解目的基因启动子启动子的筛选AprorigalKpKO1终止密码子采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针质粒pKO1上受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株含有外

3、源启动子活性的重组克隆启动子启动子的构建-35区序列-10区序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac启动子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11Plac启动子启动子的可控性P乳糖启动子Plac的可控性：OPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基基底水平转录底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的

4、转录大幅提高启动子启动子的可控性Plac乳糖启动子Plac的可控性：OPlacO高效转录葡萄糖代谢野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP基底水平转录结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAMP减少，也能阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5CAPcAMPcAMP浓度降低PlacUV5O高效转录启动子启动子的可控性Ptrp色氨酸启动子Ptrp的可控性：Otrp除去色氨酸色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转

5、录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸基底水平转录或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目基因的表达色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效转录阻遏蛋白（IAA）OtrpPtrp高效转录OtrpPtrp启动子启动子的可控性l噬菌体启动子PlL的可控性：噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达。但在大型细菌培养罐中迅速

6、升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达PtrpABcI857PL目的基因阻遏作用PtrpABPL表达色氨酸终止子强化转录终止的必要性外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，

7、则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率终止子强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选p

8、CP1AproriTcr筛选Apr、Tcs的转化子核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于