《放免技术》PPT课件

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1、第九章荧光免疫技术Tel:86862938E-mail:wuqian@njmu.edu.cn吴倩南京医科大学NanjingMedicalUniversity卫生检验系第一节概述一、荧光的基本知识二、荧光物质第二节荧光抗体技术一、标本的制作二、荧光抗体的制备三、荧光抗体染色与结果判断四、荧光显微镜的基本结构第三节荧光免疫分析的类型一、时间分辨荧光免疫测定二、荧光偏振免疫测定三、荧光酶免疫测定第四节荧光免疫技术在医学检验中的应用一、荧光抗体技术的应用二、荧光免疫测定的应用第一节概述荧光（fluorescence）荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其

2、回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。一、荧光的基本知识取决于物质本身的结构及其周围的介质环境光致荧光化学荧光阴极射线荧光发射光谱和激发光谱发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。荧光的基本知识荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式:荧光效率=如何得到最高的荧光效率？荧光的基本知识荧光淬灭定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、亚甲蓝、碱性复红、低浓度的高锰酸钾、I-等。作用：以减弱非特

3、异性本底。荧光的基本知识荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。荧光的基本知识荧光偏振FH－FLP＝──────FH＋FL荧光的基本知识荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。具备的条件二、荧光物质（1）具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合蛋白质后不易解离，而未与蛋白质结合的色素及其降解产物容易被清除；（2）荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；（3）荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明。（4）结合蛋白质后，不影响蛋白质的生化性质及免疫学活性，而且色素与蛋白质结合的方法简单而快

4、速，结合物稳定，易于保存。（5）安全无毒，不具有附加的抗原性。荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橘红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术Eu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定常用的荧光物质第二节荧光抗体技术荧光抗体技术的

5、基本原理荧光色素与特异性抗体以共价键牢固结合，而不影响该免疫血清的抗体活性，成为荧光标记的抗体，在一定条件下使之在涂片上或组织切片上与标本中的待测抗原特异性地结合，然后采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，激发标本中结合的荧光素而产生荧光，借助荧光检测仪察看荧光现象或测量荧光强度，从而判断抗原或抗体的有无、定位和分布情况，或检测受检标本中抗原（抗体）的含量等。荧光抗体技术的内容抗体的纯化抗体的荧光色素标记标记抗体的纯化荧光标记抗体染色荧光显微镜检查抗体要求高纯度高特异性高亲和力高效价一、荧光抗体的制备有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不

6、易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求荧光抗体的制备抗体的荧光素标记标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基（-NH2）与FITC的异硫氰基(-N=C=S)在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法:搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非

7、特异染色较低，但荧光素用量多。荧光抗体的制备温度、时间pH蛋白含量荧光素纯度荧光素用量荧光抗体标记影响因素荧光抗体的制备去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光抗体的纯化荧光抗体的制备目的？荧光素与蛋白结合率：F/P=抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：免疫电泳或交叉免疫电泳抗体特异性染色滴度：倍比稀释荧光抗体的鉴定荧光抗体的制备-20℃：保存1～2年真空干燥：长期保存荧光抗体的保存荧光抗体的制备组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴结等

8、器官或组织