《放免wang》PPT课件

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1、第六章放射免疫分析和其他免疫分析竞争放射分析竞争放射分析利用放射分析技术，定量分析超微量物质标记物待测物+特异结合试剂(限量)竞争结合反应定量分析(10-9～10-12g)概述竞争放射分析分类原理特点放射免疫分析法RIA利用放射性测量的高灵敏度免疫学抗原－抗体高特异性结合灵敏度高特异性强重复性好准确性好操作简便竞争性蛋白结合分析法CPBA同RIA特异试剂－甲状腺素结合球蛋白不需制备抗体易取材灵敏度、特异性不如RIA放射受体分析法RRA激素受体－激素的特异性结合特异试剂－组织受体几乎所有受体和一些神经递质

2、均可用RRA测定但受体的稳定性、保存等问题限制其应用竞争放射分析特点2．特异性强1．灵敏度高10-9～10-12g10-15g3．操作简便4．应用广泛放射免疫分析Ag*>Ab放射性核素标记抗原和非标记抗原同时与限量的特异抗体进行竞争结合反应(定量)（限量）Ag*＋AbAg*-AbAg-AbAg（待测物或标准品）基本原理放射免疫分析基本假设3．Ａg+Ab.Ag、Ab反应服从一级质量作用定理4．反应过程能完全达到平衡1．抗原（Ａg）、抗体(Ab)仅以一种化学形式存在2．Ag*、Ag具有相同理化性质5．结合抗

3、原和游离抗原完全分离，平衡不受影响6．结合抗原和游离抗原的比率能精确测定放射免疫分析根据质量作用定理得到平衡结合常数P＋ＱＰＱＫＡ＝Ｋ1／Ｋ2＝[PQ]／[P][Ｑ]＝[PＱ]／[P][q－PＱ]平衡结合常数（Ag*-Ab和Ag-Ab）复合物浓度（Ag*+Ag）游离Ag浓度Ab初始浓度放射免疫分析设R=BF因此B+F=1B1－B1－FR=BF＝＝BF[PQ][P]＝B×pF×p＝＝[PQ]B×p＝（1－F）pF放射免疫分析B与p的函数关系q=+—B2B（1++qp——KAp•)——p0——1标准品061

4、218B%20406080100放射免疫分析F与p的函数关系标准品061218F%20406080100——F—F2（1-——qp-1)——KA•p=0-qpKA•放射免疫分析R与p的函数关系R2+R(1+KA•p-KA•q)-KA•q=0R标准品06121812放射免疫分析放免的基本试剂标准品特异抗体标记物放射免疫分析标准品一级标准品二级标准品定量依据按每次用量分装保存化学结构化学纯度保存放射免疫分析对标记物的要求标记抗原0.1Ci/mg(3.7GBq/mg)生物活性和免疫活性高比活度放化纯度>95%

5、①最大结合百分率Ag*(少量)＋Ab(过量）→Ag*无损，则结合百分率无变化标记物鉴定方法放射免疫分析放射免疫分析②标准曲线法241683220406080100结合%放射免疫分析特异抗体1．基本概念抗原半抗原(Hapten)人工抗原半抗原＋蛋白质→人工抗原抗血清放射免疫分析2．制备半抗原＋蛋白质→人工抗原（1）（HSA、BSA、牛甲状腺球蛋白、卵清蛋白等）（2）动物免疫接种免疫原的乳化免疫原＋福氏完全佐剂→乳剂(油包水)动物选择免疫接种家兔、驴、马皮下多位点、趾间放射免疫分析表示血清中Ab的浓度或含量

6、KA滴度亲和力特异性交叉反应%质量鉴定3.滴度放射免疫分析定量Ag*＋Ab反应达到平衡时，抗血清的稀释度一组试管中加入:相同量标记抗原[Ag*]不同稀释度的抗血清[Ab]反应达平衡后,测复合物放射性B%↓50%抗血清B抗血清A稀释度曲线16256409665536100%B%抗血清稀释倍数放射免疫分析亲和力KA的测定Scatchard作图法饱和法Sips函数法特定的抗原与抗体之间的结合能力以亲和力常数KA表示>108L/mol放射免疫分析B/F[PQ]斜率=-KAScatchard作图法BFKAKA=-

7、q××[PQ]KA的单位：L/molKA和q与灵敏度的关系灵敏度qKA放射免疫分析特异性=A50B50×100%A待测物B类似物B50A50↓50%100%lg浓度B%交叉反应%＝待测物用量类似物用量×100%相同量Ab，相同量Ag*A组:B组：不同量待测物A不同量类似物B相同量Ab，相同量Ag*单克隆抗体：特异性↑↑多克隆抗体：放射免疫分析来自杂交瘤细胞的无性繁殖免疫动物法放射免疫分析分离技术对分离方法的要求：1.B、F尽可能完全分开,分得成分便于放射性测量.2.操作简便,分离迅速,重复性好,适合大量

8、样品分析.3.分离效果不受外界干扰因素影响.4.NSB(Non-specificBinding)低.5.试剂来源广泛,经济廉价.放射免疫分析1.电泳法2.吸附分离法3.微孔滤膜法4.固相法固相抗体+抗原+固相复合物载体材料抗体分离技术5.非特异性沉淀法Ag-Ab+盐类、有机溶剂→共沉淀→分离常用:聚乙二醇(PEG)、硫酸铵放射免疫分析放射免疫分析6.双抗体沉淀法抗原+抗体可溶性复合物+抗体可沉淀复合物第一第二放射免疫分析7.双抗体-PEG法