《细胞化学染色》课件

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1、临床血液学和血液学检验第四章造血检验的基本方法华中科技大学同济医学院医学检验系陈万新第二节细胞化学染色细胞化学（或组织化学）是在细胞形态学的基础上运用无机化学、有机化学或生物化学等技术研究细胞在发育、增殖分化过程中的主要化学成分的定位、定量及代谢功能状态的学科，是细胞形态学的重要组成部分。细胞化学染色一般包括固定、显示、复染等步骤。主要用于：显示细胞或组织的酶、蛋白质、糖类、脂类、无机盐（如铁）等化学成分的含量及分布状况；研究细胞组织来源及分化程度；为疾病的诊断、鉴别诊断及治疗提供重要的依据。中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）㈠.原理：

2、方法一（偶氮偶联法）：在PH9.2~9.8的碱性溶液中，细胞中的碱性磷酸酶能将底物磷酸萘酚钠水解，生成a-萘酚和磷酸钠，再以稳定的重氮盐与萘酚偶联生成不溶性有色偶氮染料沉淀，定位于细胞浆中。试剂：1.固定剂：1∶9福尔马林乙醇液，即40％甲醛溶液（福尔马林）10ml加无水乙醇90ml混合即得。2.a-磷酸萘酚钠溶液：100mga-磷酸萘酚钠溶于100ml0.2mol/L（pH9.1～9.7）Tris缓冲溶液中，混匀后4℃保存。3.Tris缓冲溶液（0.2mol/LpH9.2）：Tris粉（三羟甲基氨基甲烷）2.43g溶于100ml蒸馏水

3、中，加浓盐酸0.2ml（0.167ml）。4.工作液配制（临用时现配）：取a-磷酸萘酚钠溶液1.5ml于试管内37oC水温箱中预热5分钟，加坚固篮BB盐1.5mg，混匀即可。染色步骤：1、干燥涂片（观察片及阳性对照片），滴加固定剂布满血膜固定5秒钟，流水冲洗，待干或滤纸吸干。2、滴加作用液室温下（或37oC）染色15～20分钟，流水冲洗，待干。3、中性红溶液复染3分钟，流水冲洗，干后鏡检。结果判断：阳性反应呈蓝黑色颗粒状，定位于细胞浆中。计数方法：按碱性磷酸酶活性强弱，分为5级(0－IV或0－++++)。0级0胞浆呈原色，无颗粒。Ⅰ级+

4、胞浆呈浅灰色，阳性颗粒占胞浆的25%－50%。Ⅱ级++阳性颗粒约占胞浆面积的50%－75%。III级+++阳性颗粒占胞浆面积的75%－100%。Ⅳ级++++胞浆充满蓝黑色致密的阳性颗粒，占胞浆面积的l00%，甚至遮盖胞核。每例的血片，均计数100个中性粒细胞（杆状核及分叶核粒细胞），求出NAP阳性细胞的百分比(阳性率)，并按酶活性的强弱不同，求得阳性指数(积分)。0级0胞浆呈原色，无颗粒。Ⅰ级+胞浆呈浅灰色，细小蓝黑色颗粒占胞浆面积的25%～50%。Ⅰ级+胞浆呈浅灰色，细小蓝黑色颗粒占胞浆面积的25%～50%。Ⅱ级++胞浆呈棕色片状沉淀

5、，小到中等颗粒约占胞浆面积的50%～75%。Ⅱ级++胞浆呈棕色片状沉淀，小到中等颗粒约占胞浆面积的50%－75%。Ⅲ级+++胞浆充满棕黑色沉淀，分布均匀，中到大颗粒占胞浆面积的75%－100%。Ⅲ级+++胞浆充满棕黑色沉淀，分布均匀，中到大颗粒占胞浆面积的75%－100%。Ⅳ级++++胞浆充满深黑色致密的团块状沉淀，甚至遮盖胞核，中到大颗粒占胞浆面积的l00%。注意事项：1.重氮盐以坚固篮BB盐为最佳，其次为坚固篮B盐及坚固篮RR盐。2.也可用新鲜配制的六偶氮副品红为重氮盐，配方为：10mla-磷酸萘酚钠溶液中加六偶氮副品红50μl，其

6、NAP阳性反应呈红色颗粒状。六偶氮副品红：4%副品红（2N盐酸）溶液与4%亚硝酸钠溶液1∶1混合，静置1min。3.重氮盐应适量，过量会导致染色失败，出现假阴性；量不足，则阳性反应较弱。4.工作液配好后应立即使用（5min以内）。需用感染发热病人或正常人外周血涂片作为阳性对照。㈡.正常分布：阳性反应主要见于成熟中性粒细胞（杆状及分叶粒细胞）中，反应结果以阳性率和积分值报告。正常参考值：成人NAP阳性率28.7％（20%－40%），积分32.1（20－80）。㈢.临床意义：⒈类白血病反应与慢性粒细胞白血病的鉴别诊断：前者显著增高，阳性率常

7、达90%以上，积分常高于200分；后者显著减低，积分可为0。⒉细菌性化脓性感染时，积分显著增高；病毒性感染时多为正常或稍低。⒊淋巴细胞白血病时常增高；单核细胞白血病时正常或增高；慢性中性粒细胞白血病时增高，其它各型粒细胞白血病时减低；白血病伴感染时增高。⒋真性红细胞增多症、骨髓纤维化、再生障碍性贫血时增高，PNH时常减低。5.某些肿瘤的鉴别诊断，如骨肿瘤、消化道肿瘤的肿瘤细胞碱性磷酸酶常为较强阳性反应。酸性磷酸酶染色（ACP）方法一：Gomori硫化铅法原理：在酸性条件下（pH4.7）酸性磷酸酶能将底物（甘油磷酸钠）水解，产生－PO43

8、-，与Pb2+作用生成磷酸铅沉淀，定位于胞浆中酶活性存在处，再与硫化铵作用，生成棕黑色的硫化铅沉淀。试剂：1.固定剂：40%甲醛溶液（福尔马林）。2.工作液配制：蒸馏水37ml0.2mol/LpH4.7醋酸