非受体酪氨酸激酶c-Abl抑制剂诱导线粒体损伤并抑制线粒体自噬

《非受体酪氨酸激酶c-Abl抑制剂诱导线粒体损伤并抑制线粒体自噬》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：谛硷穗签字日期：加Iy年}月刁日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅

2、。本人授权安徽大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：诱时纷君签字日期：2．o1，年s月司日锄鲐。帚噼签字日期：,d---、，一r年厂月三7日万方数据摘要摘要c．Abl(cellularAbelsongeneproduct，c—Abl)是非受体酪氨酸激酶超家族Abelson的成员，在细胞生长和生存的许多重要信号通路，如细胞骨架重塑、细胞迁移和粘附、受体内吞作用、自噬、DNA损伤反应和细胞凋亡、促进自噬

3、体进入溶酶体以及溶酶体组件的正常工作等方面都有重要作用。受到氧化压力刺激，c．Abl进入线粒体可以介导线粒体功能损伤和细胞死亡。正常情况下，细胞内c．Abl活性比较低，电离辐射或氧化应激时被激活。由于染色体易位形成BCR．Abl融合基因，其编码的BCR—ABL融合蛋白呈组成性激活状态，是导致慢性粒细胞性白血病(CML)的主要原因。c—Abl的抑制剂STl571(又称伊马替尼，格列卫)是90年代开发的酪氨酸激酶4qlN齐,J类药物，是全世界第一个靶向小分子药物，在BCR．Abl阳性急、慢性白血病的治疗中发挥了重要作用。持续使用该

4、药的病人，其预期寿命己与正常人群没有显著区别。有文献中己经报道STl571可以升高细胞的活性氧水平，同时将表皮生长因子抑制剂联合STl571用药可协同促进tEtJ,细胞肺癌细胞凋亡。线粒体是真核细胞氧化产能的重要场所，它通过内膜上的呼吸链复合物之间的协作，氧化还原呼吸作用底物并耦合电子传递产生ATP。在线粒体和亚线粒体颗粒以及完整的细胞中，呼吸作用除了可以维持细胞正常代谢之外，不可避免会产生一些活性氧族如H202、超氧阴离子、氢自由基及羟基自由基。特别是当线粒体呼吸作用受到抑制或者功能紊乱时，会大量产生活性氧族。线粒体产生的活

5、性氧族对细胞会产生毒性，诱使细胞死亡。线粒体受到损伤后，其表面蛋白会被泛素修饰，并与溶酶体融合，以清除受损伤的线粒体，该过程被称为线粒体自噬(Mitophagy)a凋亡诱导因子(apoptosis-inducingfactor，AIF)定位于线粒体内膜上，是呼吸链复合物I的组成部分，具有维持线粒体稳态和促凋亡双重作用。正常生理条件下，AIF作为依赖于NADH的氧化还原酶，参与呼吸作用；当线粒体受损时，AIF经特定蛋白酶切割，从线粒体内膜脱离并转移到细胞核，引发染色体凝聚和DNA片段化，从而诱导细胞凋亡。但是AIF对细胞内ROS

6、的产生及线粒体自噬的关系尚无相关报道。万方数据非受体酪氨酸激酶c—Abl抑制剂诱导线粒体损伤并抑制线粒体自噬实验室前期研究结果已证实c．Abl能够与AIF相互作用，且导致AIF磷酸化。本研究在前期研究的基础上，首先通过免疫共沉淀，纯化在c—Abl表达细胞中表达的Flag．AIF，SDS．PAGE电泳分离出AIF蛋白，切取含有AIF的蛋白胶块，通过LC．MS／MS串联质谱鉴定，发现AIF蛋白的Y170和Y253可以被磷酸化。为进一步研究c．Abl对AIF的Y170和Y253位点的特异性磷酸化，针对Y170和Y253这两个酪氨酸磷

7、酸化位点，我们合成了磷酸化的多肽，通过免疫家兔制备了相应的位点特异性磷酸化抗体，AIF．Y(170)．P—Tyr和AIF．Y(253)．P．Tyr。通过Y(170F)、Y(253F)单一突变体和Y(170253F)双突变体的免疫印记实验，验证这两个位点的特异性磷酸化。为研究c．Abl磷酸化AIF的生物学意义，我们设计并合成干扰AIF基因表达的siRNA序列，经过逆转录病毒载体包装、转染到A549细胞中，用嘌呤霉素筛选出基因组整合有干扰序列siRNA的阳性克隆株，并通过免疫印记验证，AIF基因表达水平降低80％以上，成功构建了A

8、IF敲低的A549稳定细胞系。采用免疫荧光技术，绿色荧光二抗FITC标记AIF，红色Mitotrackerred染料标记线粒体，在镜下观察发现AIF敲低的线粒体有片段化损伤现象。实验室前期研究结果己证实c．Abl抑制剂STl571能够造成线粒体损伤，进一步研究这一现象，我们发