《高效液相色谱》课件

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1、高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC1高效液相色谱法一、高效液相色谱法的特点二、流程及主要部件三、固定相和流动相四、主要分离类型五、影响分离的因素2以液体作为流动相的色谱过程HPLC定义3高效液相色谱法的特点高压---150~350x105Pa高效---3万塔板/米高灵敏度---10-9~10-11g高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法4GCHPLC流动相惰性气体（无亲和性，只起运载作用）气体、沸点较低的化合物不同极性的液体（有一定亲

2、和作用）温度较高一般室温分析对象高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物GC与HPLC比较5（一）分配色谱（二）吸附色谱（三）离子交换色谱法（四）排阻色谱法高效液相色谱法的类型6分配色谱液液分配色谱(LLPC)键合固定相分配色谱(LSPC)分配色谱法(PartitionChromatography)液体固定相通过物理吸附固定于载体表面有机分子通过化学反应键合到载体表面7分配色谱–分离原理不同组分在两相间分配系数不同8固定相---物理吸附（担体+固定液）全多孔型担体薄壳型微珠担体分配色谱固定相

3、固定相---化学键合R---极性基团疏水基团离子交换基团9固定相的化学构造非键合相表面键合相表面ODCC18C8C1Phenyl-NH2-CN10正相HPLC（normalphaseHPLC）：是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相HPLC（reversedphaseHPLC）：由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶

4、(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。ODS（OctaDecyltrichloroSilane)11正相分配色谱反相分配色谱固定相性质极性非极性键合基团极性基团疏水基团流动相性质非极性极性出峰顺序极性小先出极性大先出12吸附色谱法分离原理溶质与流动相分子在吸附剂表面上的吸附竞争13吸附色谱固定相以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。14离子交换色谱固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或

5、无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。分离原理固定相分离对象离子或可离解的化合物（无机离子、氨基酸、蛋白质等）15分离原理根据样品分子尺寸大小分离大分子不能进入多孔中，不被保留，随Vm流出中分子部分进入多孔中，一般保留小分子完全进入多孔中，长时间保留。排阻色谱法(凝胶色谱法)161.软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物，聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）2.半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，经化学键合处理，不随压力及溶剂改变尺寸，（

6、高效排阻色谱）排阻色谱固定相17高分子化合物分子量及分子量分布DNA碎片不同碱基支链分离。应用18流动液贮存提供脱气输液泵进样系统分离系统检测系统控制与记录系统高效液相色谱仪19日本岛津公司20美国Waters公司21（1）真空泵抽滤系统（2）低溶性惰性气体导入替换（3）超声脱气（4）在线脱气流动相脱气方法22输液系统高压输液泵：高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。活塞泵注射泵气动泵23进样系统不使整个压

7、力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓六通阀24色谱柱色谱柱泵泵12进样不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱，通常使用所谓六通阀进样系统25色谱柱色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。26检测器用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器蒸发光散射检测器质谱检测器27单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光片可以到254，280，313，334，365等。生化中用到很多。

8、多波长光度计类似，光栅或棱镜分光A＝lg（I0/It)=εbc紫外-可见检测器28荧光检测器许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。特点：有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高23个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。29荧光检测器结构示意图光源检测器滤光片检测室30蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的