周培养基的制备与灭菌

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1、微生物学实验余文英、杨志波第一章培养基的制备与灭菌一、目的与要求：1、了解培养基的配制原理，掌握制备培养基的过程。2、学习高压蒸汽灭菌操作技术。3、了解干热灭菌操作要点。培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。一般来说，培养基包括有水份、碳源、氮源、无机盐类以及生长因素等五大类营养成份。此外还得有适宜的PH值，一定的渗透压（即浓度）以及氧化还原电位等。1、培养基的分类（1）根据培养基原料来源不同：天然培养基、合成培养基、半合成培养基（2）根据物理性状分为：液体培养基、固体培养基

2、、半固体培养基（3）根据培养目的不同：鉴别培养基、分离培养基、选择培养基天然培养基制作－－－－PSA培养基：用于分离和培养真菌（了解此次不做）马铃薯200g,葡萄糖(或蔗糖)10-20g,琼脂17-20g,水1000mL;将马铃薯洗净去皮,加水1000mL煮沸30min,用纱布滤去马铃薯,加水补足1000mL,然后加糖和琼脂,加热使琼脂完全熔化,分装入三角瓶.2、培养基的配制（1）称药：按下列培养基的配方准确称取各成分，放在称量纸上称量。阿斯毕无氮培养基：甘露醇（或蔗糖、葡萄糖）10gKH2PO40.2gMgSO4

3、.7H2O0.2gNaCl0.2gCaSO4.2H2O0.1gCaCO35g琼脂20g水1000mLPH自然121oC灭菌30min（2）溶化：用烧杯先装少许水,依次将药品倒入铝锅中，加足水，然后在电炉上加热溶化。（3）PH值：用精密的PH试纸测定，并用1%氧化钠或5%盐酸调节到所需的PH值。（4）过滤：趁热用纱布将培养基进行过滤。（5）分装：过滤后根据不同需要，立即趁热装入试管或三角瓶等容器中，分装如图：由一班同学每人做两管,其装量为管高1/6~1/5注意事项：（1）不要使培养基沾在管口，如沾上，需用干净的纱布擦

4、干净。（2）液体培养基：分装高度以试管的1/4左右为宜。（3）固体培养基：分装试管，其装量为管高的1/6~1/5灭菌后制成斜面。分装三角瓶容量之一半为宜。（4）半固体培养基：分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。（6）做棉塞装好培养基的试管都要加上棉塞，这样既可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发，制棉塞的方法多种，形状各异，总原则如下：（1）用脱脂棉制作（脱脂棉花易吸水）（2）松紧适合（3）塞头不要太大，一般为球状。（7）包装试管口或三角瓶口棉塞部分，用牛皮纸扎，以防灭

5、菌时水蒸气打湿棉塞。（8）灭菌灭菌是指杀死物品上或环境中的所有微生物。灭菌方法可分为四种：物理灭菌、机械灭菌、化学灭菌和生物灭菌。物理灭菌：1、热力灭菌：2、紫外光灭菌：一般应用于无菌室和接种箱的灭菌。热力灭菌：干热灭菌：适用于玻璃仪器，将物品放入烘箱，160~170oC，1~2小时。火焰灭菌：适用于常用用具，如接种环、镊子等。灭菌方法是放在火焰上直接灼烧。湿热灭菌：(1)高压蒸汽灭菌：适用于培养基、衣物等的灭菌。（2）间歇蒸汽灭菌：适用于不耐高温的培养基或无高压蒸汽灭菌锅时。（3）巴斯德灭菌：适用于牛乳类等不耐高

6、温的物体。紫外光灭菌：一般应用于无菌室和接种箱的灭菌。原理与区别基本原理：即通过不同的加热方法，使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的,蛋白质的凝固变性与蛋白质中含水量的多少有关，含水量较多者，其凝固所需要的温度低，反之，含水份较少者需要高温才能使蛋白质凝固。因此杀灭芽孢比杀灭营养体所需的温度高。干热灭菌与湿热灭菌的区别：在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时水蒸汽穿透力强，水蒸汽的导热性也强。而且当蒸汽与被灭菌的物体接触凝为水时，又可放出热量，使被灭菌物

7、体温度迅速增高，从而增加灭菌效力。高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌锅是一个耐高压又密闭的金属锅。它是利用在密闭条件下产生高压蒸汽来达到灭菌的效果。其温度在100oC以上，有强大的杀菌能力。因此它是一种用途广泛，效率高的灭菌工具。分类：1、卧式2、立式操作步骤：（1）加入适量自来水于灭菌锅中（至水位线）（2）摆入上述包装好的待灭菌的培养基，注意：不要摆得太挤，以免影响蒸汽流通和灭菌效果。（3）加盖旋紧螺旋，使蒸汽锅密闭不漏气（对角线均匀拧旋）（4）打开放气阀，打开电源，自开始产生蒸汽后10分钟（此时蒸汽锅内的冷空气由排气阀排

8、尽）关紧放气阀，让温度随蒸汽压力上升而上升，当达所需压力时（15磅/时2）控制热源维持所需时间（30分钟）然后停止加热，让其自然冷却。（5）待压力降至0磅时，打开排气阀，再打开锅盖，取出灭菌物。注意：压力未降至0磅时，切勿打开锅盖，否则突然降压，招致培养基沸腾，沾湿棉塞，甚至冲出管外。（6）自锅中取出灭菌好的培养基，放置稍冷却后摆成斜面，而后至37oC恒温箱