Westernblot实验技术(I)

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1、Westernblot实验技术曹红2012.11.15定义：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法。Westernblot原理WesternBlot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分

2、离蛋白质混合物，经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。由于Westernblot检测技术具有简便，快捷等特点，所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。WesternBlot信号放大基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。WesternBlot一般流程底片扫描

3、、分析底物显色二抗孵育一抗孵育封闭转膜SDS-PAGE电泳蛋白样品的制备培养细胞：洗掉培养基，PBS洗2~3次，加入裂解液，用细胞刮刀将贴壁细胞刮下，超声波匀浆器匀浆，冰上静置30分钟，4度，12000转，离心15分钟，收集上清.组织样品：快速取材、液氮速冻、按每80毫克组织加1毫升的比例加入裂解液,超声波匀浆器匀浆，静置60分钟，4度，12000转，离心15分钟，收集上清.样品保存：避免反复冻融样品，EP管分装-20度保存，不要超过2周，最长不要超过1个月；-80度（或-70度）保存，一般不超过半年，最多1年。裂解液：Tris-HCl,EDTA,NP40，CHA

4、PS,PMSF，proteininhibitor,（磷酸酶抑制剂：氟化钠、钒酸钠）蛋白样品的制备BCA（bicinchoninicacid,二辛可酸）法测定蛋白浓度原理：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm除有高地光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。浓度检测范围：10-2000ug/ml步骤：(1)标准品与待测样品稀释(至检测范围）；(2)与等体积WR工作液混合；(3)37度反应2hr；(4)测定562nm处光密度(OD)值;(4)绘制标准曲线并计算蛋白浓度SDS-PA

5、GE（polyacrylamidegelelectrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应.SDS（十二烷基硫酸钠）是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例的SDS后後,由于SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量的蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白

6、的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺SDS配胶的Tris缓冲液（积层胶：PH=6.8；分离胶：PH=8.8）TEMED（四甲基己二酸），加速剂，催化APS产生自由基过硫酸铵(现配现用)：产生自由基，并引发丙烯酰胺单体聚合Tris-甘氨酸电泳缓冲液（PH=8.3）凝胶成份SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。不连续体系由电极缓冲液、凝胶（积层胶和分离胶）所组成。积层胶是由APS催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HCl。分离胶是由APS催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓

7、冲液为pH8.8Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，因而其分离条带清晰度及分辨率均较好。凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212制备样品样品缓冲液：1）SDS：断裂分子内和分子间的氢键，取消蛋白质分子内的疏水作用，使分子去折叠，破换蛋白分子的二、三级结构；去除蛋白质电荷。2）强还原剂：如beta巯基乙醇或DTT（二硫苏糖醇），能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂3）

8、溴酚蓝：指