城市污水厂(AO 工艺) 微生物群落结构及其动态变化

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1、.城市污水厂（A/O工艺）微生物群落结构及其动态变化赵继红1，楼燕1，余志晟21.河南工业大学化学与化工学院，河南郑州450001；2.中国科学院研究生院资源与环境学院，北京100049摘要：为了研究城市污水厂（A/O工艺）活性污泥中微生物群落结构及其动态变化，分别在运行不同时期从曝气池中提取活性污泥，通过细胞裂解直接提取活性污泥中的细菌基因组DNA，以细菌16SrDNA通用引物F357/R518，对活性污泥中提取的细菌基因组进行扩增，长约230bp的扩增产物经变性梯度凝胶电泳（DGGE）分离，获得微生物群落的DNA特征指纹图谱。结果显示，城市污水厂（A/O工艺）活性污泥中的微生物群落

2、非常丰富，在不同时期存在一些各自的特有种属和共有种属，细菌群落结构的演替与系统负荷存在一定的相关性。整体来说，微生物群落演替不明显，微生物群落相似性较高，群落结构较为稳定。关键词：PCR-DGGE；A/O工艺；群落结构；动态变化中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1672-2175（2008）03-0898-05..活性污泥微生物群落结构、稳定性和恢复性能在维护污水生物处理系统的有效性中起着重要作用[1]，及时监测活性污泥微生物种群结构在不同冲击负荷下的动态变化，可以系统地优化群落结构，并对群落结构的失调做出早期预警。然而，传统的微生物研究方法，如显微镜观察和分离培养无法满足对

3、群落结构进行动态跟踪研究的要求。因此，用分子生物学的方法从微生物种群结构动态变化的角度，揭示污染物负荷与污水处理系统的相互关系，逐步改变污水处理系统的黑箱操作状态，已成为环境微生物分子生态学中一个具有重要理论价值和应用前景的研究方向[2-3]。提取样品中微生物的总DNA，进行16SrDNA的扩增及后续的分子分析(例如denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)已经被证明是研究复合菌群结构的一种有效的研究手段，并被广泛应用于环境复合菌群结构的研究[4-8]。本研究运用聚合酶链式反应（PCR）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）等现代分子技术研究城市污水厂

4、（A/O工艺）活性污泥中微生物的群落结构及其变化动态。1材料与方法1.1污水处理厂概况本研究从郑州市王新庄污水厂取样，该厂位于郑州东开发区，采用A/O工艺，设计处理能力为40万t/d。1.2样品采集2007年6月、7月、8月期间，不定期的从正在运行的活性污泥系统的曝气池中进行取样。所用取样器具均进行了灭菌处理，取样后立即将样品放入冰盒保存，并于2h内送回实验室，样品经前处理后放入-20℃冰箱保存。1.3活性污泥样品的预处理及DNA的提取参照高平平等人的方法[9]，对污泥样品进行预处理，解絮凝，去除部分腐殖质。采用修改后的CTAB法从污泥样品中提取基因组DNA。运用SDS裂解和bead-

5、beating均质结合的方法对样品进行裂解。方法如下：①将前处理过的污泥样品沉淀悬浮于1mL抽提液（100mmol/LEDTA，100mmol/LTris，200mmol/LNaCl，w=2％CTAB，w=1％PVP，pH8.0）中，加入2颗灭菌玻璃珠（d：2～3mm），充分漩涡5min后，加入2mLSDSbuffer（w=10％，Ph8.0），漩涡混匀后放置冰浴中20min；②加入10μL蛋白酶K（20mg/mL），37℃温育1h；③将上述处理液以10000r/min，4℃离心5min后收集上清液，加入1∶1的饱和酚抽提上清液，12000r/min，4℃离心5min，取上清后加入1∶

6、1的Tris饱和氯仿抽提，10000r/min，4℃离心5min，取上清后加入0.6倍体积的预冷的异丙醇放置在－20℃冰箱中，30min或过夜沉淀DNA后12000r/min离心5min；④弃上清，干燥，用灭菌过的超纯水溶解沉淀即为所得的基因组DNA粗提液；⑤采用上海生工的柱式DNA胶回收试剂盒（NO.SK1132），按操作说明进行纯化。样品即用或于－20℃冰箱冻存。1.4基因组DNA的PCR扩增用于DGGE的PCR扩增引物：上游引物为F357GC（5`－CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3`）；下游引物

7、为R518（5`－ATTACCGCGGCTGCTGG-3`）。..图1基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1Agarosegel(0.7%)electroresisPCR反应（第1轮）采用50μL的反应体系，其组分为：1μL的DNA模板、0.5µmol/L每种引物、200µmol/LdNTP（每种10mmol/L）、1×PCRbuffer（with1.5mmol/LMgCl2）、1.25UTaqDNA酶，用适量无菌超纯水补足至50μL。图2