大连理工大学,生化实验报告

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1、说明：下面黄色标注的为必须改的地方，其他地方自己酌情修改。2013年生物化学实验B实验报告姓名：XX学号：201144XX实验时间：2013年10月20日实验分组：第X组组内成员：XXXXXXXXX任课教师：XXX小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量、SDS-PAGE电泳法测定蛋姓名班级摘要本实验通过从小牛肠中提取小牛肠碱性磷酸酶，利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，并测定酶的活性。最后通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量.关键词小牛肠碱性磷酸酶提取酶活测定考马斯亮蓝法SDS-P

2、AGE电泳法本实验分为三部分。先通过对牛小肠内膜的刮取，离心，沉淀析出等方法，提取牛小肠碱性磷酸酶；然后用考马斯亮蓝G-250与碱性磷酸酶结合，利用紫外分光光度计在一定波长下测定结合物的吸收波长，根据其吸光度与蛋白质结合物的含量成正比的关系测定蛋白质含量，进而测定出蛋白质的比活力；最后，通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量，分析所获得的电泳结果来推算出被测蛋白质分子量的近似值。1实验部分1.1试剂与仪器1.1.1小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定1、试剂（1）正丁醇、丙酮（置-20℃冰箱保存）（2）1

3、mol/L醋酸（HAC）、1mol/LNaOH、硫酸铵（3）平衡缓冲液：0.01mol/LTris-HCL,PH8.0,(含1.0×10-3mol/LMgCl2和1.0×10-5mol/LZnCl2)。（4）底物缓冲液：1mol/L二乙醇胺-盐酸缓冲液（PH9.8，含0.5×10-3mol/LMgCl2）。（5）酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10-3mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液。（已加入底物缓冲液中）2、仪器匀浆机、冷冻离心机、恒温水浴、紫外可见分光光度计、离心管、剪刀、载玻片、不锈钢盘、搪瓷盘、滤布

4、、漏斗、分液漏斗、量筒、烧杯、移液枪、比色皿1.1.2考马斯亮蓝法测定蛋白质含量1、试剂考马斯亮蓝、实验小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定所得酶液、生理盐水2、仪器分光光度计、分析天平、玻璃比色杯、试管及试管架、移液枪1.1.3SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量1、试剂1）30%丙烯酰胺（acrylamide,Acr）置棕色瓶。2）分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HCL缓冲液，pH8.8，已加入10%SDS。3）浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTris-HCL缓冲液，pH6.8，已加入10%SD

5、S。4）10%过硫酸铵（AP）（小离心管装，提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合所必须的自由基，须新鲜配置。）2）TEMED（四甲基乙二胺）（小离心管装T，通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合）3）上扬缓冲液（小离心管装S）：称100mgSDS、2mg溴酚蓝、2g甘油，加0.1mL巯基乙醇、2mL-。-5mol/LpH8.0Tris-HCL,加超纯水定容至10mL。4）染色液：配置含0.1%考马斯亮蓝R250,40%（体积分数）甲醇和10%（体积分数）冰醋酸的染色液500mL，过滤后备用。

6、5）脱色液：500mL10%（体积分数）甲醇和10%（体积分数）冰醋酸的脱色液1000mL。6）电泳缓冲液（含0.1%SDS，0.05mol/LTris，0.384mol/L甘氨酸pH8.3）.2、仪器电泳仪、电泳槽、制胶板、摇床、移液枪1.2实验过程1.2.1小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定1、酶的分离提纯1）取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片刮去小肠内粘膜，放到盘子一角。2）统一将小肠黏膜液集中倒入匀浆机中，加1.5倍体积冰冷蒸馏水，高速匀浆15s，重复20次。3）缓慢加入（总体积）1倍体积的冰冷正丁

7、醇，高速匀浆15s，重复20次。每组领取60mL的匀浆液，放入离心管中（离心管装液量不能超过70%），用另一离心管用水配平（切记离心前连同离心管盖子一起用天平配平），在4℃条件下，10000rpm，离心15min（离心管对称放置）。4）用滤布过滤去除杂质（滤饼），倒入分液漏斗中，静止分层（勿摇），去下层水相，用1mol/LHAc调pH到4.9。4℃，10000rpm，离心10min。5）得到上清26.5mL，放入离心管中，用1mol/LNaOH调pH至6.5，称取质量为溶液体积5%的硫酸铵1.33g(5g硫酸

8、铵/100mL溶液)，加到离心管中溶解；再加0.47倍体积（12.45mL）冰冷丙酮，混匀，4℃（冰箱中）静置30min以上。4℃，10000rpm，离心10min。6）上清液36.5mL中加入1.07倍体积（39.06mL）冰冷丙酮，4℃静置30min以上。4℃，10000rpm，离心10min。7）取沉淀溶于2mL平衡缓冲液至全部溶解。置冰箱保存待用。2、底物处理底物（对硝基苯磷酸二钠已溶于平衡