叶绿素荧光研究技术

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1、叶绿素荧光分析技术在植物生理生态研究中的应用KautskyandHirsh（1931）发现，将暗适应的绿色植物突然暴露在可见光下后，植物绿色组织发出一种暗红色，强度不断变化的荧光（Kautsky效应）。荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。叶绿素荧光现象的发现上世纪80年代，Ögren（1985）和Schreiber（1986）相继创制出便携的调制式荧光仪，并实现了商品化。叶绿素荧光动力学研究得到广泛应用的原因1、叶绿素荧光动力学特性包含着光合作用过程的丰富信息●光能的吸收与转换●能量的传递与分配●反应中心的状态●过剩光能及其耗散●

2、光合作用光抑制与光破坏……等等2、可以对光合器官进行“无损伤探查”，获得“原位”的（insitu）信息。3、操作步骤简单快捷。由于以上原因叶绿素荧光动力学技术在：●光合作用生理生态●逆境生理等研究领域得到了较快的普及和广泛的应用直观的叶绿素荧光现象叶绿素溶液在投射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。荧光现象的本质是什么？为什么活体植物的叶片看不到荧光现象？叶绿体吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体（LHC），LHC将其能量传递到光系统2或光系统1。其间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸收的光能被重新发射出来，其波长较长,也即叶绿素荧光.透

3、射光下反射光下当一个叶绿素分子a的电子从激发态回到到基态的去激过程中，一小部分激发能（3-9%）以红色的荧光形式耗散。在生理温度下，叶绿素荧光的波长峰值大约为685nm的红光，并且一致延伸到800nm的远红光处荧光是研究光能分配的探针激发能光化学反应形成同化力热耗散荧光CO2固定光呼吸Mehler反应N代谢通过调节PSII反应中心的开放的程度干涉荧光的发射，根据不同情况下荧光的变化来分析光合机构运行情况。ΦF=kfkf+kp+kdФF:叶绿素荧光产量；kf：叶绿素荧光的速率常数；kp：光化学反应的速率常数；kd：热耗散的速率常数荧光发射与原初光

4、化学活动、热耗散过程是互相竞争的一种关系。因此，荧光产量的变化反映了光化学效率和热耗散能力的变化。如何测定叶绿素荧光？现有两类荧光仪可以用来测定叶绿素荧光。1.续激发式荧光仪（如PEA)，必须将测定叶片在避光下测定，在照光条件下，仪器无法区分叶绿素荧光和自然光中与荧光波长相同的红光和远红光。但是这类荧光仪有很高的分辨率，每秒钟能够测定10万次荧光变化，因此是研究光合机构中电子传递瞬间变化的有力工具。2.脉冲调制式荧光仪（如FMS-2)，可以避免上述问题。在测定时，仪器提供一种脉冲调制式光，能诱导出的脉冲式的荧光。当有其它光线同时存在时，会产生以

5、下三种光信号：1.自然光中具有荧光波长的红光信号2.自然光诱导的非脉冲荧光信号3.脉冲调制光诱导的脉冲荧光信号脉冲调整式叶绿素荧光仪原理图1：调制测量光；2：作用光；3：饱和脉冲光；4：远红光；5：检测器及放大器；6：短波通过滤光片；7：长波通过滤光片；8：样品（5）（6）7）8高选择性监测器可以排除前两种信号而只保留脉冲过程中所产生的荧光信号。用脉冲调制式方法，可以在全光照情况下测量叶绿素荧光信号，而不被其它光所干扰。当对暗适应叶片照光时，叶绿素荧光迅速上升，随后有一系列的慢的波动，逐渐下降到稳态。这称为“KautskyEffect”，是Ka

6、utsky等在1931年首先报道的。荧光产量的变化反映了光化学效率和热耗散能力的变化。最大荧光荧光波动荧光稳态荧光快速上升过程将时间标尺放大后的荧光动力学曲线对（KautskyEffect）的解释：连续光下荧光产量瞬态上升，这是因为照光后某些碳同化酶需要光活化，因此碳同化途径产生延迟。这使得照光初期相当多的QA处于还原状态，从而导致了荧光产量的瞬态上升。这之后，由于光化学过程和热耗散过程的发生，荧光产量产生淬灭到一个稳态数值（Ft）。暗反应光活化过程XPheoQFdPQNADPCytfO2PCP700光量子H2OZP680光量子光合电子传递链

7、Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm；qP=(F’m-Ft)/(F’m-F’o)；ΦPSII=(F’m-Ft)/F’m；NPQ=(Fm-F’m)/F’m；qNP=(Fm-Fm’)/(Fm-Fo’)t(Fs)主要荧光参数及其意义Fo：初始荧光产量（Originalfluorescenceyield）也称基础荧光，是PSⅡ反应中心（经过充分暗适应以后）处于完全开放状态时的初始荧光产量。Fm：最大荧光产量（Maximalfluoreseenceyield），是PSⅡ反应中心完全关闭时的荧光产量。通常叶片经暗适应20min后测得。Fv=Fm-Fo：可变荧光

8、，反映PSⅡ的电子传递最大潜力。经暗适应后测得。Fv/Fm：暗适应下PSⅡ反应中心完全开放时的最大光化学效率，反映PSⅡ反应中心最大光能转换效率。Fv