基因工程制药par1

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1、第二章基因工程技术制药9/16/20211一、概述---几个概念基因工程技术？是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。9/16/20212基因工程药物？系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的新型药物。一、概述---几个概念9/16/20213基因工程药物上游阶段？

2、主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞）目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。一、概述---几个概念9/16/20214基因工程药物下游阶段？从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。一、概述---几个概念9/16/20

3、215制备基因工程药物的一般程序一、概述获得目的基因组建重组质粒构建基因工程菌（或细菌）培养工程菌除菌过滤半成品检定包装9/16/20216传统制药存在的问题许多在疾病诊断、预防和治疗中有重要价值的内源性活性物质（如激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类等人体活性多肽）以及某些疫苗，由于材料来源困难或者制造技术问题而无法研制出产品而付诸应用。从动物脏器中提取出来（比如动物脑垂体中的一些肽类激素，包括肾上腺皮质激素、催产素起引产或催产作用，胃肠道类激素缓激肽等），也因造价太高，或来源困难而供不应求。一、概述9/16/20217传统制药存在的问题由于免抗原等缘故（由于酶的

4、相对分子量较大，对人体可能具有抗原性，因此动物酶如作为注射用药要经过大量的药理实验），使他们在使用上受到限制。在提取过程中难免有病毒感染，因此还可能会对病人造成严重后果。一、概述9/16/20218基因工程技术的特点就是能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。一、概述9/16/20219基因工程技术的特点可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供

5、有效的保障；可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源一、概述9/16/202110二、目的基因的获得从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。原核细胞不能直接克隆真核基因。来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，是不能进行直接分离的，原因有二：9/16/202111二、目的基因的获得Ⅰ逆转录法目的克隆真核基因常用的方法

6、有逆转录法和化学合成法：DNA序列不含内含子9/16/202112二、目的基因的获得1mRNA的纯化利用mRNA的3’末端含有polyA的特点，在RNA流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度洗脱时，或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱下来，经过两次寡聚（dt）纤维素柱后，可得到较高纯度的mRNA。9/16/202113二、目的基因的获得2cDNA第一链的合成一般mRNA都带有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。一次好的逆转录可使寡聚dT选出的mRNA有5%

7、~30%被拷贝。9/16/202114二、目的基因的获得3cDNA第二链的合成先用碱解或RHase酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电泳进行测定。9/16/202115二、目的基因的获得4cDNA克隆用于cDNA的克隆载体有两类：质粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌体DNA（如λgt10、λgt10）等。根据重组后插入的cDNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。在DNA克隆操作中应根据不同的