基因结构与功能分析1

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1、生物化学与分子生物学第二十二章基因结构与功能分析技术TheAnalysisTechnologyforGeneStructureandFunction人类的多种疾病都与基因的结构或功能异常有关，因此，要阐明疾病发生的分子机制和进行有效的诊断与防治，均需首先揭示基因的结构与功能。DNA序列测定基因转录起点及其启动子的分析基因编码序列的分析基因拷贝数及其表达产物的分析基因功能获得和/或缺失策略随机突变筛选策略第一节基因结构分析技术一、基因一级结构解析技术基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序，解析一级结构最精确的

2、技术就是DNA测序（DNAsequencing）。（一）双脱氧法和化学降解法是两种常规的DNA测序方法Sanger双脱氧测序（dideoxysequencing）法Maxam-Gilbert化学降解测序法（二）全自动激光荧光DNA测序技术的原理基于Sanger双脱氧法1.四色荧光法：采用四种不同的荧光染料标记同一引物或4种不同的终止底物ddNTP，最终结果均相当于赋予DNA片段4种不同的颜色。因此，一个样品的4个反应产物可在同一个泳道内电泳。2.单色荧光法：采用单一荧光染料标记引物5′-端或dNTP，所有产

3、物的5′-末端均带上了同一种荧光标记，一个样品的四个反应必须分别进行，相应产物也必须在四个不同的泳道内电泳（三）焦磷酸测序是一种基于发光法测定焦磷酸的测序技术焦磷酸测序技术操作简单，结果准确可靠，可应用于单核苷酸多态性位点（SNP）分析、等位基因频率测定、细菌和病毒等微生物的分型鉴定、CpG甲基化分析、扫描与疾病相关基因序列中的突变点等领域。该方法的测序长度一般短于Sanger法。（四）循环芯片测序被称为第二代测序技术循环芯片测序（cyclic-arraysequencing）①可实现大规模并行化分析②不需

4、电泳，设备易于微型化③样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本优势：技术平台：454测序、Solexa测序（Illumina测序）、SOLiD测序等。基本流程：①将基因组DNA随机切割成为小片段DNA；②在所获小片段DNA分子的末端连上接头，然后变性得到单链模板文库；③将带接头的单链小片段DNA文库固定于固体表面；④对固定片段进行克隆扩增，从而制成polony芯片。⑤针对芯片上的DNA，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到DNA链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。（五）单分子测序技

5、术被称为第三代测序技术主要策略：①通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序，如单分子实时技术（singlemoleculerealtimetechnology，SMRT）；②利用DNA聚合酶在DNA合成时的天然化学方式来实现单分子测序；③直接读取单分子DNA序列信息。二、基因转录起点分析技术转录起点（transcriptionstartsite，TSS）（一）用cDNA克隆直接测序法鉴定TSS以mRNA为模板，经逆转录合成cDNA第一链，同时利用逆转录酶的末端转移酶活性，在cDNA第一链的末端加上p

6、olyC尾，并以此引导合成cDNA第二链。将双链cDNA克隆于适宜载体，通过对克隆cDNA的5-末端进行测序分析即可确定基因的TSS序列。该方法比较简单，尤其适于对特定基因TSS的分析。但可导致5-末端部分缺失，从而影响对TSS的序列测定。（二）用5-cDNA末端快速扩增技术鉴定TSS常用的技术包括5-末端基因表达系列分析（5-endserialanalysisofgeneexpression，5-SAGE）和帽分析基因表达（capanalysisgeneexpression，CAGE）技术。（

7、三）用数据库搜索TSS利用对寡核苷酸帽法构建的全长cDNA文库5-末端测序所得的数据信息建立了一个TSS数据库（databaseoftranscriptionstartsites，DBTSS），并在此基础上，通过将寡核苷酸帽法和大量平行测序技术相结合开发了一种TSS测序法，从而实现了一次测试可产生1×107个TSS的数据。三、基因启动子结构分析技术（一）用PCR结合测序技术分析启动子结构该方法最为简单和直接，即根据基因的启动子序列，设计一对引物，然后以PCR法扩增启动子，经测序分析启动子序列结构。（二）用

8、核酸-蛋白质相互作用技术分析启动子结构1.用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点足迹法（footprinting）是利用DNA电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA区域，它是研究核酸-蛋白质相互作用的方法，而不是专门用于研究启动子结构的方法。分类：酶足迹法化学足迹法（1）用核酸酶进行足迹分析酶足迹法（enzymaticfootprinting）是利用DNA酶处理DNA-蛋白质复合物，然后通过电泳