《基因表达干扰技术》PPT课件

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1、基因表达干扰技术1基因表达干扰技术二、核酶与脱氧核酶三、小干扰RNA四、微RNA一、反义核酸技术2一、反义核酸技术概念:反义核酸:是根据碱基互补原理设计的,针对特定靶序列互补的DNA或RNA片段，通过与特定靶序列结合，从而抑制特定基因的表达。3反义核酸技术:是根据碱基互补原理，用人工合成或生物体内合成的特定互补的DNA或RNA片段抑制或封闭基因表达的技术种类：反义DNA反义RNA来源：人工合成生物合成4（一）反义寡核苷酸(反义DNA)（ASON）技术反义DNA:是人工合成的与待封闭基因的某一区段互补

2、的正常或化学修饰的DNA片段，用来抑制或封闭这一基因的表达。51.反义寡核苷酸的作用机制(1)抑制mRNA的翻译(2)抑制复制或转录(3)抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达6降解反义核酸靶核酸二聚体空间阻碍碱基互补抑制基因表达782.反义寡核苷酸的给药途径（1）直接作用于培养细胞（直接进入细胞）（2）结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞（通过载体进入细胞）（3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径9（二）反义RNA技术反义RNA是指能和mRNA完全互补的小分子RNA片段，其

3、与mRNA结合后可影响mRNA的正常修饰和翻译，从而调节基因表达。101.反义RNA的作用机制(1)抑制DNA复制：与引物RNA结合，抑制复制(2)阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运与mRNA互补结合影响加帽、剪接和加尾(3)抑制mRNA翻译与5′端SD序列、起始密码AUG结合，影响翻译(4)使mRNA更易被核酸酶识别而降解112.反义RNA的设计与ASON相比，反义RNA的设计较为简单PCR→反义基因+载体→重组反义基因→细胞→反义RNA12（三）反义核酸技术的应用1.基因分析2.可作为探针进行

4、原位杂交，分析基因表达3.用于病毒病、肿瘤及遗传性疾病的治疗13二、核酶与脱氧核酶（一）核酶核酶是一类具有催化作用的RNA分子，能够特异性地剪切底物RNA或突变的RNA。141.核酶的分类（1）大分子核酶：（2）小分子核酶：152.核酶的结构（1）锤头状核酶：二级结构有三个螺旋环结构区和一个催化中心16（2）发夹形核酶：每个结构域由螺旋-环-螺旋组成173.核酶的设计与修饰设计：核酶核心与结合臂的设计在底物RNA中选择最佳的剪切位点修饰：防止被核酸酶降解184.核酶转移方法核酶需转入细胞内才能发挥功

5、能方法：外源性转移内源性转移195.核酶的应用病毒性疾病的治疗乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒艾滋病毒肿瘤的治疗20核酶的作用21（二）脱氧核酶具有催化作用的DNA（人工合成）221.脱氧核酶的结构种类及特征（1）10-23型脱氧核酶：23（2）8-17型脱氧核酶：242.脱氧核酶的催化特性（1）RNA切割活性（2）DNA连接酶活性（3）卟啉金属化酶和过氧化酶活性（4）DNA切割活性（5）N-糖基化酶活性（6）DNA激酶活性（7）DNA戴帽活性253.脱氧核酶的应用为治疗RNA病毒感染的疾病提供了一条新途径

6、二、核酶与脱氧核酶26三、小干扰RNARNA干扰（RNAi）：利用特定的小分子单链RNA与一条mRNA的互补区发生碱基配对，从而阻遏这条mRNA的表达。把这条小分子的RNA称为小干扰RNA（siRNA）27（一）一般研究路线28（二）RNAi的作用机制1.起始阶段2.效应阶段3.倍增阶段2930（三）siRNA的导入1.脂质体或电穿孔2.病毒携带3.细胞穿透肽（四）RNAi沉默效果的检测检测mRNA或蛋白质31（五）RNAi的应用1.基因功能的研究2.基因剔除3.基因治疗4.细胞信号转导途径分析5.

7、药物开发32四、微RNA（miRNA）是一组短小，一般为20~24个核苷酸组成，本身不具有开放阅读框架，具有高度保守性、时序性和组织特异性的小分子RNA。33miR-#（#代表数字）表示miRNAmir-#（#代表数字）表示相应的编码基因（一）miRNA的命名34（二）miRNA的作用机制1.起始阶段：细胞内源性基因→单链初级转录产物2.成熟阶段：单链初级转录产物→70核苷酸前体miRNA→胞质→21核苷酸的miRNA3.功能阶段：miRNA+蛋白质→核糖核蛋白复合物→(Pri-miRNA)(Pre

8、-miRNA)抑制mRNA翻译调节基因表达3536（三）siRNA与microRNA的区别共同点①由22个左右的核苷酸组成②是Dicer酶的产物③需Argonate家族蛋白的存在④与RISC形成复合物起干扰、调节作用⑤可在转录后、翻译水平上干扰靶mRNA37siRNA与microRNA的不同siRNAmicroRNA外源性内源性由长dsRNA经Dicer酶切割得到由pre-miRNA经Dicer酶切割而来双链单链与靶mRNA完全互补配对与靶mRNA并不完全互补AGO2