《宏基因组文库构建》PPT课件

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1、宏基因组文库构建威斯腾生物技术中心400-675-6758什么是文库？Library基因文库（也称DNA文库）是指某一生物体全部或部分基因的集合，就像一个没有目录的“基因图书馆”基因文库的组成：外源DNA片段：研究对象基因组DNA或cDNA载体：质粒载体（plasmid）、黏粒载体（cosmid）、人工染色体（BAC、YAC）等宿主：大肠杆菌（E.coli）、酵母（Saccharomycescerevisiae）1976年L.Clark,J.Carbon提出了一个完全的基因文库所需克隆的计算公式n=ln(1-p)/ln(1-f)n:一

2、个完全基因文库所应包含的重组体克隆数p:所期望的目的基因在基因文库中出现的几率f:插入片段的平均大小与基因组DNA大小的比值哺乳动物3×109kb若p=99%平均克隆片段20kbf=20kb/3×109n=690773.2E.coli4639221bpp=99%f=20kb/4600kbn=1056.9p=99%f=10kb/4600kbn=2116若这些大量的重组DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA，而是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA，它们所构成的重组DNA克隆群体，则称之为cDNA基

3、因文库cDNA文库:可装载的外源DNAPlasmid<10kbλPhage0-23kbCosmid~45kbBAC~100kbYAC~300kb-1.2Mb载体的选择：粘粒克隆所需的克隆子数是λphage的一半，如λ需700000时，cosmid需350000个如无特殊需要(如单个λphage不能包容靶基因片段或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆时)一般不采用cosmid，因其在构建文库和贮存文库比λphage困难得多YAC可用于克隆500kb以上，甚至几Mb的DNA片段BAC可减少DNA分子间的重组基因克隆的策略基因克隆

4、的本质从文库中筛选目标克隆，重点在“筛选”常见筛选工具:探针狭义:核酸,抗体广义:还包括其他筛选手段抗性基因:antibiotics抗性基因,抗重金属活性一、功能筛选分解基因:苯环化合物,分解酶功能活性：杀虫，酶启动子/复制子利用目标基因的特定功能进行筛选AmporiMCSTetgenewithoutpromoterVector将目标DAN切割成小片段,插入MCS在Tet平板上筛选抗性菌落,可得到promoter其他标记:gfp,Kan质粒复制单位的克隆AmporiMCS目标宿主可用的抗性gene将目标DAN切割成小片段,插入MCS在

5、抗性平板上筛选抗性菌落,可得到质粒复制单位功能缺失在获得相应突变体的前提下以此突变体作为宿主在野生型的DNA导入后检测回复突变如营养缺陷型相关的基因二、核酸探针同源DNA探针高度保守的基因rRNA基因邻近种属的相应基因相应基因的序列比较合成寡核苷酸蛋白质N-末端aa序列简并探针degeneracy选取简并程度低的aa序列综合合成可能的话设计一对,用PCR产物作探针根据密码子的使用频率,合成猜测体探针设计两组简并探针,用第二个探针对第一次筛选的阳性克隆子作第二次杂交三、免疫在可获得PT后,制备抗体,用于筛选四、高表达基因高丰度mRNA,

6、如用苯肼作了贫血处理的兔网织红细胞中,血红蛋白mRNA的含量占绝大多数五(1)、差别杂交五(2)、扣除杂交六、mRNA差别显示DifferentialdisplayPCR,DDPCR七、酵母双杂交系统用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的蛋白质基因GAL4蛋白：酵母半乳糖苷酶基因gal的转录激活因子，该蛋白结合在gal基因上游激活区(UAS)可启动gal基因的转录GAL4蛋白：可分为两个区域DNA-BD:DNA结合域,N-末端1-147aaAD:转录激活域，C-末端768-881aa什么是文库？什么是宏基因组文库？从环境样品中直接提取总

7、DNA，经纯化后部分酶切，然后把这些DNA片段连接到载体上，转化替代宿主细胞，形成一个重组DNA文库即宏基因组文库。获得的克隆子根据宿主细胞获得的新功能进行筛选,或用相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并分离目的基因片段，加上表达调控元件后使目的基因表达，从而获得产物。什么是宏基因组文库？Obtainingbacteriainpurecultureistypicallythefirststepininvestigatingbacterialprocesses.standardculturingtechniquesaccountfor1

8、%orlessofthebacterialdiversityinmostenvironmentalsamplesasuiteofculture-independenttechniquesareneededtocomple