cDNA和基因组文库DNA的构建.ppt

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1、第九章cDNA文库和基因组文库构建基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体；cDNA文库是指含有所有重组cDNA的克隆群体。 　　基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式等。cDNA文库：来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。 基因文库＝基因组文库＋cDNA文库一、载体的种类和特征：受体细胞结构插入片

2、段举例质粒E.coli环状很小，<8kbpUC18/19,T-载体,pGEM3zλ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL，λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状<10kbM13系列粘粒载体E.coli环状35-45kbBACE.coli环状约300kbPACE.coli环状100-800kbPCYPACYAC酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC哺乳动物细胞环状>1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒，二

3、、cDNA文库的构建分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接cDNA文库的构建mRNA反转录cDNA(互补DNA）第二条DNA链1：反转录酶催化合成cDNA第一链1.1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl寡核苷酸引物(1μg/μl)

4、 1μl1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl1mol/L KCl 3.5μl250 mmol/L MgCl2 2μldNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10μl0.1 mol/L DTT 2μlRNase抑制剂（选用）25单位加H2O至48μl1.2.当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。1.

5、3.大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。1.4.温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。1.5.测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。1.6.按下述方法计算cDNA第一链的合成量[掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA

6、第一链(μg)1.7.尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。2：cDNA第二链的合成2.1：cDNA第二链的合成将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中、10mMol/Lmgcl270ul2mM/LTris-Hcl(PH7.4)5ul10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol）10μl1 mol/L (NH4)2SO41.5μlRNase H (1000单位/ml) 1μl大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml) 4.5μl温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机

7、稍离心，以除去所有气泡。在16℃温育2~4h。2.2.温育结束，将下列试剂加到反应混合物中：β-NAD (50 mmol/L) 1μl大肠杆菌DNA连接酶(1000~4000单位/ml) 1μl室温温育15min。2.3.温育结束，加入1μl含有4种dNTP的混合物和2μl T4噬菌体DNA聚合酶。反应混合物室温温育15分钟。2.4.取出3μl反应物，按步骤7和8描述的方法测定第二链DNA的质量。2.5.将5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反应物中，用酚：氯仿和氯仿分别抽提混

8、合物一次。在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收DNA，将DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。2.6.将下列试剂加到DNA溶液中：10×T4多核苷酸激酶缓冲液10μlT4多核苷酸激酶（3000单位/ml）1μl室温温育15分钟。2.7.测定从上面步骤4取出的3μl反应物中放射性活度，测定1μl第二链合成产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。2.8.用下面公式计算第二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到已