欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:39527323
大小:1.87 MB
页数:15页
时间:2019-07-05
《实验三双缩脲法蛋白质含量测定》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、蛋白质含量测定双缩脲法(Biuret法)实验目的学习分光光度法测定的原理和方法学习蛋白质含量测定的原理和方法掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法实验原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有
2、:Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。蛋白质测定方法:双缩脲法(biuret法)微量凯氏(kjeldahl)定氮法folin—酚试剂法考马斯亮兰法紫外吸收法总蛋白定量分析-BCA实验试剂与器材(一)、实验试剂1、标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05NNaOH配制。2、双缩脲试剂(二)、实验器材可见
3、光分光光度计分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射下,产生了对光吸收的效应,物质对光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱,因此当某单色光通过溶液时,其能量就会被吸收而减弱,光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系,也即符合比色原理——Lambert-Beer'slaw:数学表达式:A=lg(1/T)=KCLA为吸光度T为透射率,是投射光强度比上入射光强度C为吸光物质的浓度L为吸收层厚度K为吸收系数物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的西光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度C及吸收层厚度L成正比.仪器操作键介绍“方
4、式设定”键(MODE):用于设置测试方式“100%T/0ABS”键:用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”键:用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮:用于设置分析波长样品测试操作①打开电源开关,使仪器预热20分钟②用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上③打开样品室盖,将挡光体插入比色皿架,并将其推或拉入光路④盖好样品室盖,按“0%T”键调透射比零⑤取出挡光体,盖好样品室盖,按“100%T”调100%透射比⑥按“方式键”(MODE)将测试方式设置为吸光度方式(A)⑦将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中⑧打开
5、样品室盖,将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中,盖上样品室盖⑨将参比溶液推入或拉入光路中,按“100%T”调零A⑩将被测溶液拉入光路中,此时,显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后,关闭电源,洗净比色皿,并盖好盖布。使用注意:每次测量前检查,检查波长是否所需值;比色皿应拿磨砂面,不可用手接触透光面;比色皿在盛装样品前,应用所盛样品冲洗两次,装样量为比色皿的2/3容积;向比色皿加样时,若样品流到比色皿外壁时,应用滤纸点干,切忌用滤纸擦拭,比色皿易出现划痕;测量结束后应用蒸馏水清洗比色皿,清洗干净后放起.操作方法1、标准曲线的测定取12支试管分两组,分别加
6、入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20~25℃)下放置20分钟,于540nm处进行比色测定(30分钟内必须完成测定)。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定取2-3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。思考题为什么双缩脲反应要求在30分钟内检测?谈谈BCA法测定蛋白含量的优缺点,并与其他方法比较
此文档下载收益归作者所有