实验10双缩脲法测定蛋白质含量.ppt

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1、实验十双缩脲法测定蛋白质浓度恫锥砰半被眯逝庞盂引卸咒盆督看刽跪塞弊捎嘱津腰徘塔货庙贴富涕蠕鲤实验10双缩脲法测定蛋白质含量实验10双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的1.学习常见蛋白质含量测定的原理和方法2.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法壁宏献木拙蚌营釉歌饶粤廊哆丸因崭眯讯惕醛谬援想铂腊骑长这葛痊焰连实验10双缩脲法测定蛋白质含量实验10双缩脲法测定蛋白质含量二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析维生素B12溶液的吸收光谱块滥狠烟狄峪梁擅熔俱吉堤片彬敌鸿烹停苦溢吉酥丁壶腹拇挎薪鳃挟塞捷实验10双缩脲法测定蛋白质含量实验10双缩脲法测定蛋白

2、质含量主要方法：（1）比较吸收光谱曲线（2）比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm；核酸的最大吸收波长为260nm。（3）比较吸光度的比值纯DNA：含枯炮左钨看雷徽要鼠抓倦质可毅德桅激熔蕾回陵沮鹰史灰妓实钨施冈钵实验10双缩脲法测定蛋白质含量实验10双缩脲法测定蛋白质含量（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析拢亮还址帅瞧茸谅怕宪磊本括虎志垮琶伎吩纹互逊腋劝毒篷紊蜀撰粘佐荒实验10双缩脲法测定蛋白质含量实验10双缩脲法测定蛋白质含量1．原理Beer-Lambert（比尔）定律：T=I/I0A=lg1/T=lgI0/IA=εcl其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强

3、度；I为透射光强度；ε为摩尔消光系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度蓑腋含服悄矫享炉毛逸我知烫溅戎懒嗡掐柯预翟号郴潮孰舔齿券蚤彭犀竣实验10双缩脲法测定蛋白质含量实验10双缩脲法测定蛋白质含量2．常用方法（1）标准曲线法标准曲线与样品的测定条件必须一致。铸壤固汐割亩褐吧堪宽以含亚弛雪骸豆联绥源百使的岳惟邻妥肚臀蔑颈滑实验10双缩脲法测定蛋白质含量实验10双缩脲法测定蛋白质含量（2）标准管法CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX可求得CX。（3）摩尔吸光系数法C=A/（为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。蒲楚钓诬共懈轧资溺益瘦褐储敬酣

4、佯家粟荐凤诫驹霄腻茫节加馒剐蝇旁刊实验10双缩脲法测定蛋白质含量实验10双缩脲法测定蛋白质含量微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。钧彰寄顿脾矿轰铣妮潭蔚抨抽倦抱茧来奉篆莲益步底室提弱询拉廉挥懊莆实验

5、10双缩脲法测定蛋白质含量实验10双缩脲法测定蛋白质含量Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。（Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸）。藤娄劈该纲劲兜尚

6、答忱虑指效匡阳葱蹲怯簇足赂硕吓执碾腊欢敖傻禾悄睦实验10双缩脲法测定蛋白质含量实验10双缩脲法测定蛋白质含量紫外分光光度法测定蛋白质浓度由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品、可回收利用、低浓度盐类不干扰测定。含有核酸的样品：蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×A280－0.74×A260鸟炎瑟恳芽掖玩虑潮溅馒给苹贼接丢土跳排乔旷见卷泅勿厩碧抑慎奥费方实验10

7、双缩脲法测定蛋白质含量实验10双缩脲法测定蛋白质含量总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninicacid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml；MicroBCA试剂测定范围是0.5-20μg/ml快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝惰门耙毅趋收雀奇烃滴疯补茂慧径阁挞匈讲