实验五细菌的革兰氏染色

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1、实验五细菌的革兰氏染色法一、实验目的了解革兰氏染色法的原理，学习并掌握革兰氏染色方法。二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。常用碱性染料进行简单染色，这是因为细菌的等电点较低，约在pH2～5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）等结合，使细菌被染成紫色或红色。革兰氏染色法是1884年由丹麦病

2、理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫-碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，因

3、此细菌仍保留初染时的颜色紫色。三、实验仪器及材料1.仪器：显微镜、酒精灯等2.实验材料：菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌染色剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、番红、95%乙醇四、实验内容与步骤革兰氏染色流程图涂片干燥结晶紫染色碘液媒染水洗95%酒精脱色水洗番红染色水洗晾干镜检固定水洗1．涂片取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。2．干燥涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地

4、在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。3．固定固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过2~3次，共约2~3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。4．初染用草酸铵结晶紫染色1-2min后倾去染液，水洗至流出水无色。5、媒染先用碘液冲去残留水迹，再加碘液覆盖媒染1min后水洗。6．脱色斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20~30s，随即水洗。7．复染将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红染液复染1mi

5、n，水洗，吸去残水晾干。8、镜检待标本片置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。9.混合涂片染色注意事项：1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。2.菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3.不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。五、实验结果：紫色菌：革兰氏阳性菌红色菌：革兰氏阴性菌六、思考题1、造成革兰氏染色结果不正确（假阴性或假阳性）的主要原因有哪些？2、你

6、认为革兰氏染色法中那个步骤可以省略？在什么情况下？