实验碱性磷酸酶米氏常数的测定

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1、实验五碱性磷酸酶米氏常数的测定一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数(Km)及最大反应速度(Vm)的测定原理和方法,测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km和Vm值。二、原理一、分光光度法的基本原理及方法(一)利用吸收光谱对物质进行定性分析1.原理2.主要方法:(1)比较吸收光谱曲线(2)比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm,核酸的最大吸收波长为260nm。1.苯丙氨酸2.酪氨酸3.色氨酸(3)比较吸光度的比值纯DNA(二)利用吸收光谱对物质进行定量分析1.

2、原理Beer-Lambert(比尔)定律:T=I/I0A=lg1/T=lgI0/IA=KCL其中:T为透光率;A为吸光率;I0为入射光强度;I为透射光强度;K为吸收系数;C为溶液浓度;L为溶液光程的厚度2.常用方法(1)标准曲线法OD或A浓度标准曲线与样品的测定条件必须一致。(2)标准管法CX/AX=CS/AS,已知CS,测定AS、AX,可求得CX。(3)摩尔吸光系数法C=A/(为L=1cm,C为1mol/L时的吸光系数,也称为摩尔吸光系数。(三)米氏常数的测定原理酶促反应v-[S]曲线v[S]推导出

3、米氏方程为:其中[S]为底物浓度;v为初速度;Vm为最大反应速度;Km为米氏常数米氏常数Km是酶的一个基本特征常数,它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时,米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm,可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式,即:以1/v对1/[S]作图,可得一条直线1/v1/Vm-1/Km1/[S]本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm

4、.反应式:pNPP+H2OpNP+HPO42-无色黄色可通过分光光度法测定产物pNP的含量,求出反应速度v。三、试剂与器材试剂:0.5mol/mLpNP、10mmol/LpNPP、20mmol/LMgCl2、0.1mol/L碳酸钠—碳酸氢钠pH10.1缓冲液、0.1mol/LNaOH、6mg/mL碱性磷酸酶酶液器材:恒温水浴锅、722分光光度计四、分光光度计的使用1.722型分光光度计的外形2.仪器操作键介绍“方式设定”键(MODE):用于设置测试方式“100%T/0ABS”键:用于自动调整100.0%

5、T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”键:用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮:用于设置分析波长3.样品测试操作①打开电源开关,使仪器预热20分钟②用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上③打开样品室盖,将挡光体插入比色皿架,并将其推或拉入光路④盖好样品室盖,按“0%T”键调透射比零⑤取出挡光体,盖好样品室盖,按“100%T”调100%透射比⑥按“方式键”(MODE)将测试方式设置为吸光度方式(A)⑦将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中⑧打开样品室盖,将盛有溶液的比色皿分别

6、插入比色皿槽中,盖上样品室盖⑨将参比溶液推入或拉入光路中,按“100%T”调零A⑩将被测溶液拉入光路中,此时,显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后,关闭电源,洗净比色皿,并盖好盖布。返回返回返回五、操作方法(一)对硝基苯酚标准曲线的制作取5支试管编号,0号一支,1-7号各二支,按下表操作:管号0123456pNP含量(mol)00.050.100.150.200.250.300.5mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.6H2O(mL)0.80.70.60.50.40.

7、30.2Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mLOD405nm以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标,OD405nm值为纵坐标,绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。(二)测定15支试管,1-5做两组平行测定管,01-05作为空白对照。No.12345底物终浓度[S](mM)0.50.751.01.5310mmol/LpNPP(mL)0.10.150.20.30.6蒸馏水(mL

8、)0.50.450.40.30碳酸盐缓冲液(mL)各加1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各加0.2mL预热混匀,37℃,5分钟酶液(mL)测定管各加0.2mL酶液反应时间37℃,精确反应10分钟0.1mol/LNaOH(mL)各加2mL酶液(mL)空白管各补加0.2mL酶液OD405(三)数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝

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