《植物转基因技术》PPT课件

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1、第十八章植物转基因技术植物转基因技术：又称基因重组技术或DNA重组，即将人工分离和修饰过的基因导入植物基因组中，通过导入基因的表达从而引起植物体性状的可遗传的修饰。凡是外源DNA导入细胞的过程都可以泛称为转化，包含以下内容：直接转化；介导转化；直接转化是将裸露的DNA直接导入植物细胞的转化方法。这种裸露的DNA可以是全部或部分染色体，分离的DNA，也可以是基因工程质粒；介导转化介导转化是利用另一种生物来实现基因的转入和整合。目前使用的主要是根瘤农杆菌、发根农杆菌等土壤农杆菌，转化效率较高。直接转化与介导转化都涉及以下三方

2、面:1、遗传物质导入植物细胞；2、外源DNA在植物基因组中的稳定整合；3、转基因植株的再生。一、直接转化一)目的基因的获得：(1)直接从目的生物(即供体生物)的基因组中用机械(如超声波)或限制性内切酶切断后分离出来。(2)通过反转录酶作用,以mRNA为模板,经反转录成为互补DNA(即cDNA)。(4)通过建立核基因库，然后从基因库中筛选并扩增出目的基因。(3)在体外用化学合成和酶促合成的方法来获得目的基因。二）目的基因的修饰，构成嵌合基因：嵌合基因中必有启动子（如花椰菜病毒的35s亚基启动子、19s亚基启动子），目的基因

3、及终止子。三）嵌入标记基因或报告基因：应用较广的是GUS基因；绿色荧光蛋白基因。基因枪法：微弹为0.2-2.0um的钨粉或者金粉，用超声波使外源DNA液均匀的包裹钨粉微粒手枪原理射击。四）直接转化的方法：电穿孔转化法：用短时高脉冲电处理可导致细胞膜出现可恢复性孔隙，从而发生的渗透点3－4nm为外源DNA进入细胞提供通路。PEG转化法：PEG转化法和PEG诱导原生质体融合方法相似，同样需要高钙、高pH条件从而将外源DNA插入原生质体并整合。五）、转化基因材料的分析与鉴定（1）GUS测定：GUS基因的表达产物是葡糖苷酸酶，它

4、可分解葡糖苷酸，葡糖苷酸被分解后形成蓝色产物使植物组织成为蓝色。（2）southern杂交法：用放射性同位素32P标记一段DNA分子及探针,与转化植物或其他被分析个体的总DNA杂交,可以探测转化植物是否含有与探针同源的DNA序列,通过放射自显影可看到杂交片断并测分子量大小。（3）蛋白质杂交技术：蛋白质抗原与其相应的特异抗体相结合。（4）PCR反应：根据已知转化基因或标记基因顺序设计引物，（5）遗传分析：观察基因是否可以稳定遗传给下一代。（6）鉴定转化基因的功能。实例小麦的基因枪转化1、试验材料：小麦幼胚（开花后10～12

5、天）2、质粒的制备：转化所用质粒为pABH9，该质粒插入BADH基因（表达产物是甜菜碱醛脱氢酶，提高植物细胞的调渗能力和耐盐性）和BAR基因（表达产物是PPT已酰转移酶，抗除草剂PPT，因此可利用PPT作为转化物的选择剂），由玉米启动子控制，并含有nos中止子。3、幼胚的高渗预培养：4、微弹的制备与基因枪的轰击（无菌）：5、抗PPT愈伤组织的选择：白色生长快的为外源质粒转化的愈伤（见图）。6、抗PPT再生植株的获得：（见图）实例小麦的基因枪转化7、抗PPT转化植株的耐盐性：含盐0.7％NaCl条件下转化植株表现较强的耐盐

6、性。8、转化植株的壮苗、生根、移栽、传代。9、转BADH基因植株的分子检测：根据已知的BADH结构基因设计引物用PCR法鉴定外源BADH基因是否整合到小麦基因组中。也可以进一步用Southern杂交验证。实例小麦的基因枪转化农杆菌是普遍存在于土壤中的抑制革兰氏阴性菌，能在自然条件下趋化性的感染大多数的双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤（根瘤农杆菌）和发状根（发根农杆菌）。分别含有Ti质粒和Ri质粒。二、农杆菌介导转化一）土壤农杆菌的转化机理致瘤性（tumor－inducing）是由Ti质粒上的T-DNA所致（一）.土

7、壤农杆菌感染植物的过程：（二）、Ti质粒：Ti质粒的大小约200kb左右，为双链环状DNA分子。含有T-DNA区、毒性区、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿碱分解位点.其中以T-DNA区和毒性区（vir-region）在植物转化中最为重要。T-DNA区：能够转移整合入植物受体基因组，并能在植物细胞中表达，从而导致冠瘿瘤发生。Vir区：由多个毒性基因组成，其编码蛋白对T-DNA的转移和整合必不可少。1.Ti质粒上的T-DNA：章鱼碱合成酶胭脂碱合成酶农杆碱合成酶农杆菌素碱合成酶仅存在于被感染植物细胞的细胞核中，整合到植

8、物基因组中，T-DNA以单拷贝或多拷贝形式插入植物基因组中,插入的位点也各不相同。T-DNA从农杆菌的Ti质粒转移到植物细胞中，接着T-DNA整合到细胞核基因组中进行表达，对宿主细胞进行遗传转化。在Ti质粒的两端，T-DNA有两个几乎完全相同的25bp的重复。右端重复对于T-DNA的转移和整合是必需的。T-DNA与植