已知基因序列的获取策略1

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1、已知基因序列的获取策略——兼谈引物设计与序列分析黄钢第三军医大学遗传教研室2006.11.1.获取序列信息，设计合适的引物选取相应的组织或细胞，提取RNA并RTPCR扩增获得全长cDNA装入合适的克隆或表达载体，菌落PCR、酶切与测序证实根据需要进一步进行亚克隆RNaseH消化（可选）一、如何获取已知目的基因的序列信息先查找其蛋白相关信息,了解该基因编码产物的基本情况与功能（www.expasy.org）进一步查找其核酸相关序列信息，常用数据库：Genebank、EBI、DDBJ二、目的基因cDNA序列的获取方法cDNA文库扫描RT-PCR人工合成组织RNA的

2、提取在匀浆器中加工冷冻的组织通过注射器加工冷冻的组织在液氮中将组织研磨成粉末在液氮中研磨组织至粉末状，细胞裂解更完全，产量比前二者多一倍。合适的RNA提取方法加上合适的组织处理方法，才能够获得最佳的提取效果RNA提取两要素忌讳贪多：不能指望1mlTrizol提取100mg以上组织，一般50mg用1mlTrizol较合适速战速决：尽量缩短提取时间，不要完全照搬Protocol,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的话，可以立即加入氯仿，立即离心，14000rpm离心10min,取完上清加入0.6~1体积的异丙醇，立即高速离心（14,000rpm,5min），.....

3、总之尽量快速！尽量减少RNAase污染RNase的危害主要集中在将RNApellet溶解在水中之后，防止RNA降解的重点应当放在组织样本的保存和RNA水溶液的保存上。注意实验前的准备工作：各种器材的去RNAase处理与无RNAase的准备。长期保存RNA时建议用去离子甲酰胺溶解总RNA沉淀如何确认RNA的质量RNA的电泳图谱检测RNA溶液的吸光度保温试验荧光染色、毛细管电泳和Agilent2100生物分析仪分析28S18S5SRT引物的选用GSP：适合序列肯定的模板，常用于一步法RT－PCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在扩增低丰度的转录本时是最好的。Ol

4、igodT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA片段的逆转录。RT中提高合成全长cDNA的效率消除mRNA二级结构：逆转录之前将RT引物与RNA模板进行短暂的热变性,可破坏mRNA二级结构,促进锚定引物与模板的正确配对。选用RNaseH灭活改造的新型耐高温逆转录酶：Thermoscript、SuperscriptⅢ等，RT后建议进行RNaseH消化处理。锚定RT引物的选用：5'–(T)25VN–3‘热启动RT有条件者选用Tricine-EDTABuffer溶解cDNA10mMTri

5、cine-KOH(pH8.5)1.0mMEDTA小于5微克可自己找公司合成建议用热盖PCR仪或空气浴孵箱保温建议选用RNaseH消化高保真DNA多聚酶的选用常用高保真DNA多聚酶：如Pfu、DeepVent、Vent、Pwo、KOD、Pyrobest、PrimerStar等PCR过程中HotStart与Touchdown的使用高保真DNA多聚酶与普通rTaq的混合使用PCR产物加A尾进行T-A克隆：循环即将结束时加入rTaq5U72℃保温20～30min两步变温法PCR载体构建中的常见问题利用单酶切位点将片段插入载体双酶切中的问题对过长cDNA片段:可分段扩增

6、，再利用RE位点或重叠延伸融合成全长cDNA酶切位点甲基化的问题ClaIG6mATCGATXbaITCTAG6mATC真核表达载体的选择PromoterConventional/Tissue-Specific/InduciblePoly(A)tailKozak序列：－9GCCGCCA/GCCAUGG＋4一个载体内的多基因表达IRES系统加linker直接融合表达多个独立的表达cassettes：优于共转染表达SOE技术与基因人工合成及多基因融合基因设计与人工合成中的密码子优化DNAWorks2.4(Hoover,D.andLubkowski,J.,2002)h

7、ttp://mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/SOE：Splicedbyoverlappingextension搭桥技术融合基因三、引物设计引物设计的3条基本原则：引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。引物设计注意事项引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38bp。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。5’端序列的修饰与标

8、记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖