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1、电泳技术段天璇一、基本理论1.常用公式和术语E=U/L电场强度(V/cm)=电压(V)/电极间距(cm)*相对迁移率mR=蛋白质迁移距离/示踪染料迁移距离μep=v/E=l/(tE)=lL/(tU)=q/(6πrη)(cm2/(s*V)∵F=qE=F’=6πrηvl：蛋白质迁移距离电泳速度v=μepE=μepJ/K分离度影响电泳的环境因素电泳速度v=μepE=εζE/(Cη)C:6πor4πEpH:pI(~4-7),缓冲溶液pH(~8-9.5),向？极泳动离子强度I:0.02-0.2电渗温度：焦耳热介质：孔径、制胶重复性等2
2、.分类按原理:区带电泳,(移界电泳),稳态电泳,显微电泳3.电泳仪及附属设备提供稳定直流电源的装置电压、电流、电功率稳定脉冲式电压常压电泳仪(600V):净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳高压电泳仪(3kV):载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序超高压电泳(30-50kV):毛细管电泳电泳槽板状电泳槽水平板垂直板管状电泳槽*自由界面电泳槽DYCP-33A型琼脂糖水平电泳仪(槽)(中号)DYCZ-22B型单垂直电泳仪(槽)（大号）4.电泳的支持介质特性（要求）物理化学性质稳定化学惰性均匀种类分离原理特性物质薄膜类电荷密度化学
3、惰性对流扩散小纸、醋酸纤维素薄膜、聚酰胺薄膜凝胶类电荷密度分子大小同上+多孔性分子筛效应（淀粉）、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、新型凝胶介质5.检测-染色方法考马斯亮蓝：常用荧光染料：灵敏硝酸银：灵敏酶活性免疫学：专一特殊蛋白质糖蛋白、脂蛋白、铁蛋白、铜蛋白三苯基甲烷衍生物，-SO3--蛋白质的碱性基团——染料-蛋白质复合物。R型G型二甲花青亮蓝-甲基取代的三苯基甲烷衍生物染色固定蛋白质-染色-脱色同时固定和染色-脱色脱色30%甲醇的10%乙酸溶液等二、琼脂糖凝胶电泳agarosegelelectrophoresis支持介质：
4、琼脂糖结构：1,3连接的β-D半乳糖和1,4连接的3,6脱水α-D半乳糖线性联结成琼脂糖，琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成交联结构特点：大孔胶，适于核酸、线性DNA,RNA分离分析分离原理：0.2-50kb操作形式：水平电泳、免疫电泳、平板等电聚焦AgaroseD-galactose3,6-anhydroL-galactose性能指标电内渗、胶凝温度、熔化温度、凝胶强度、脱水收缩作用纯度：硫酸根含量少，纯度高应用：核酸研究,不同浓度凝胶分离200bp-50kbDNA检测：荧光染料溴乙啶，电泳后染色操作过程：见Agarose
5、GelElectrophoresis.ppt三、醋酸纤维素薄膜celluloseacetatefilm纤维素-乙酰化特点定量准确性提高：吸附少、染色背景脱色较快速：电渗小灵敏度高，样品用量少：5微克蛋白质薄膜可保存操作简单快速价廉应用领域：血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、脱氢酶、多肽等四、聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE以polyacrylamidegel为分离介质分离原理：电荷密度+分子筛特点应用领域操作形式(圆盘电泳)垂直板电泳水平板电泳1.聚丙烯酰胺凝胶polyacrylamidegel,PAG聚合化学聚合光聚合总浓度与交联度单体
6、交联剂催化剂丙烯酰胺+N,N’-亚甲基双丙烯酰胺————PAGAcrBis加速剂过硫铵(AP)-化学聚合or核黄素VB12–光聚合N,N,N’,N’-四甲基乙二胺TEMED反应影响因素产物特点应用浓度、比例、pH、温度、含氧、杂质等孔径较小分离胶光照条件孔径较大浓缩胶总浓度与交联度的影响凝胶浓度T=[(a+b)/m]100%(g/mL)交联度C=[b/(a+b)]100%a=mAcr;b=mBis;m=Va/b：凝胶性状、孔径、分子筛效应等C=6.5-0.3T浓度筛选：标准凝胶T=7.5%或梯度胶凝胶孔径CTnm151525
7、6.62.41.92.88.02.31.62.43.610.01.91.42.03.012.01.7915.01.47蛋白质相对分子量适用凝胶浓度蛋白质相对分子量适用凝胶浓度<1万20-3010-50万5-101-4万15-20>50万2-54-10万10-152.连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(1959)凝胶孔径、缓冲液（样品、凝胶、电极）不变分离原理：样品电荷特点：制胶简单、条件简单恒定、分辨率不高适用：简单样品3.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳含义：不同胶孔径、不同缓冲液分离原理：电荷效应+分子筛效应特点：样品成分浓缩-分离，分辨率
8、高；操作复杂适用：广泛应用的主要电泳技术3种物理效应样品浓缩；分子筛效应；电荷效应不连续性凝胶浓度：浓缩胶-分离胶缓冲液离子成分缓冲液pH电位梯度制胶分离胶样品胶浓缩胶抽气浓缩胶储液:2(10%Arc+2.5%Bis)1.0mol/LTris-HCl缓冲液pH6.8:140%蔗糖:4TEM
