分子生物学之疾病相关基因的鉴定与基因功能研究

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1、疾病相关基因的鉴定与基因功能研究疾病相关基因是医学分子生物学最重要的领域，因为几乎所有的疾病都与基因结构或表达变化有关，都是遗传因素和环境因素相互作用的结果。疾病相关基因致病基因：一种疾病的表型和一个基因型呈直接对应的因果关系，即该基因结构或表达的异常是导致该病发生的直接原因疾病易感基因：环境因素和遗传因素均起着一定作用，表现为2个以上基因的“微效作用”的相加，或者多基因间的相互作用，而单一基因变异仅增加对疾病的易感性第一节鉴定疾病相关基因的原则一、鉴定疾病相关基因的关键是确定疾病表型和基因间的实质联系正确的诊断是鉴定疾病基因的先决条件确定疾病的遗传因素，即通

2、过孪生子分析，领养分析和同胞罹患率分析等确定遗传因素是否在疾病发病中的作用及其作用程度。二、鉴定克隆疾病相关基因需要多学科多途径的综合策略疾病相关基因鉴定克隆策略示意图三、确定候选基因是多种克隆疾病相关基因方法的交汇有许多途经能够达到最终鉴定疾病相关基因的目的，这些方法最终将交汇在候选基因上。一旦候选基因被鉴定，即可筛检患者中该基因的突变。候选基因可不依赖其在染色体位置而予以鉴定，但常用的策略仍然是首先找出候选染色体区域，然后在此区域内鉴定候选基因。第二节疾病相关基因克隆的策略和方法一、不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆策略不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆策

3、略包括功能克隆、表型克隆及采用位点非依赖的DNA序列信息和动物模型来鉴定和克隆疾病基因。（一）从已知蛋白质的功能和结构出发克隆疾病基因功能克隆（functionalcloning）采用的是从蛋白质到DNA的研究路线，针对的是一些对影响疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病1．依据蛋白质的氨基酸序列信息鉴定克隆疾病相关基因2．用蛋白质的特异性抗体鉴定疾病基因（二）从疾病的表型差异出发发现疾病相关基因表型克隆（phenotypecloning）基于对疾病表型和基因结构或基因表达的特征联系已经有所认识的基础上来分离鉴定疾病相关基因1.从疾病的表型出发，比较患者基因组DNA

4、与正常人基因组DNA的不同，直接对产生变异的DNA片段进行克隆，而不需要基因的染色体位置或基因产物的其他信息。2.针对已知基因。如果高度怀疑某种疾病是由于某个特殊的已知基因所致，可通过比较患者和正常对照间该基因表达的差异来确定该基因是否为该疾病相关基因。3.针对未知基因的，可通过比较疾病和正常组织中的所有mRNA的表达种类和含量间的差异，从而克隆疾病相关基因。这种差异可能源于基因结构改变，也可能源于表达调控机制的改变。依据DNA或mRNA的改变与疾病表型的关系，可有几种策略：针对未知基因常用的技术有mRNA差异显示（mRNAdifferentialdispla

5、y，mRNA-DD）抑制消减杂交（suppressivesubstractivehybridization，SSH）基因表达系列分析（SAGE）cDNA微阵列（cDNAmicroarray）基因鉴定集成法（integratedprocedureforgeneidentification）RDA技术原理和基本过程示意图mRNA-DD技术原理和基本过程示意图（三）采用动物模型鉴定克隆疾病相关基因人类的部分疾病，已经有相应的动物模型。如果动物某种表型的突变基因定位于染色体的某一部位,而具有相似人类疾病表型的基因很有可能存在于人染色体的同源部位。另外，当疾病基因在动物

6、模型上已完成鉴定，还可以采用荧光原位杂交来定位分离人的同源基因。二、定位克隆是鉴定疾病相关基因的经典方法定位克隆（positionalcloning）：仅根据疾病基因在染色体上的大体位置，鉴定克隆疾病相关基因。定位克隆的起点是基因定位，即确定疾病相关基因在染色体上的位置，然后根据这一位置信息，应用DNA标记将经典的遗传学信息转换为遗传标记所代表的特定基因组区域，再以相关基因组区域的相连重叠群（contig）筛选候选基因，最后比较患者和正常人这些基因的差异，确定基因和疾病的关系。（一）基因定位的方法1．体细胞杂交法通过融合细胞的筛查定位基因2．染色体原位杂交是在

7、细胞水平定位基因的常用方法3.染色体异常有时可提供疾病基因定位的替代方法4．连锁分析是定位疾病未知基因的常用方法（二）定位克隆的基本程序包括三大步骤1．尽可能缩小染色体上的候选区域2．构建目的区域的物理图谱3.疾病相关基因的确定（三）假肥大型肌营养不良基因的克隆是定位克隆的成功例证首先，根据患病女性X染色体与第21号常染色体的易位，以及男患儿发生小的Xp21.2缺失并伴发三种其他X连锁隐性遗传病，再运用RFLP连锁分析将DMD基因定位于Xp21。然后，分别克隆得到了基因的2个不同的片段，分别命名为XJ系列探针和pERT87系列探针，根据两片段的比较，证明DMD

8、基因约为2300kb，占X染色体的1%