白蛋白测定与线性范围试验

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1、血清总蛋白（TP）测定与线性范围试验邹佳峻一、双缩脲法测定血清总蛋白（TP）二、线性范围试验1.实验目的：掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、方法熟悉722分光光度计的使用了解TP测定的临床意义一、双缩脲法测定血清总蛋白（TP）+Cu2+OH-2.实验原理：CO(NH2)2+CO(NH2)2缩合H2N-OC-NH-CO-NH2紫红色化合物（1）双缩脲反应：OH-蛋白质分子中的肽键+铜离子紫红色复合物（-CO-NH-）Cu2+紫色复合物在540nm波长有特定的吸收峰，其颜色的深浅（吸光度）与蛋白质的浓度在一定范围内成

2、正比。此反应和2个尿素分子缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与Cu2+作用生成紫红色复合物的反应相似，故称双缩脲反应。（2）双缩脲法测定TP的原理3.实验材料：试剂：（1）商品双缩脲试剂（2）自配双缩脲试剂（3）血清样品（4）总蛋白标准液（70.0g/L）器材：试管、加样枪、吸量管、722分光光度计、水浴箱4.实验方法：取5支试管，按下表操作：另取5支试管，按下表操作：5.实验结果：参考值：60~82g/L结合实验数据分析结果进行讨论,用SPSS13.0分析两组数据间有无统计学意义（配对t检验）。6.总蛋白测定的临床意义：

3、（1）血清总蛋白浓度增高见于：a.蛋白质合成增加（如多发性骨髓瘤）；b.血浆浓缩（如呕吐、严重腹泻、高烧）。（2）血清总蛋白浓度降低见于：a.蛋白质合成障碍（如肝严重受损）；b.蛋白质丢失增加（如严重烧伤、肾病综合征）；c.营养不良或消耗增加（如低蛋白饮食、严重结核病、甲亢）；d.血液稀释。配对样本是指同一样本进行两次测试所获得的两组数据，或对两个完全相同的样本在不同条件下进行测试所得的两组数据。SPSS13.0操作：1、录入数据；2、选择菜单：Analyze>CompareMeans>Paried-SampleTTe

4、st3、生成统计结果，查看P“sig.(2-tailde)”（值（P值>0.05，可以认为两种方法的结果差别无显著性差异；P<0.05，有显著性差异。）7.注意事项：（1）样品中TP含量超过100.0g/L则用蒸馏水稀释后测定，结果乘以稀释倍数。（2）黄疸、溶血标本对本法有干扰，故用标本空白管来消除。（3）取量要准确，操作要规范。8.思考题：（1）氨基酸可以用双缩脲法测定吗？为什么？（2）结合实验数据分析结果进行讨论，最后得出本次实验的结论。二、线性范围试验1.实验目的：通过线性范围的测定，选择线性段作为该测定方法的分

5、析范围。掌握线性范围试验的评价及意义。熟悉线性范围试验的具体操作过程。在比色分析中，在符合Lambert-Beer定律的条件下，有色溶液的吸光度与被测物质浓度成正比。以标准物质浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，可在普通方格纸上绘出一条直线，即剂量反应曲线或校正曲线。2.实验原理：在此情况下，待测物浓度与吸光度的比值为一常数，直线上任何一点的斜率tanθ都相等，即tanθ=A1/C1=A2/C2=A3/C3=……An/Cn=K此处K即为校正常数。在实际工作中并不存在理想的反应曲线，当被测物浓度过高、仪器处于非理想状态时，

6、都可导致对Lambert-Beer定律的偏离，出现正偏离和负偏离现象。因此，新建立的分析方法，其线性范围尚未确定时，为较准确地测出该方法符合Lambert-Beer定律的浓度范围，我们需要进行线性范围的测定。线性范围的确定：要求能覆盖临床上的参考值和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀释重测的机会。3.实验材料：试剂：自配双缩脲试剂、TP标准液、质控血清（用蒸馏水稀释，浓度为120g/L）。需用到的公式：C1*V1=C2*V2器材：试管、加样枪、吸量管、722分光光度计、水浴箱。取试管31支，除空白管外，1~10号管各

7、做3个平行管，一共有10个浓度。按表三加样：4.实验方法：5.实验结果：所得数据如实填入表四：6.注意事项：（1）标本、试剂的加量必须十分准确，应用加样枪进行加样。（2）稀释时，应使测定管系列成为精确的浓度等差系列。（3）质控血清稀释时，要严格规范操作，准确加样。（4）同一浓度应采用三管平行操作，初步判断测出的吸光度值，若相差超过0.100，应去掉其中的异常数值后再算平均值。（5）标准溶液和样品溶液的蛋白质浓度均应超过10mg/mL。7.数据处理与分析：（1）用Excel软件制作出浓度C对吸光度值A的标准曲线图，求出线

8、性范围。（2）采用SPSS13.0软件对线性范围内的浓度C与对应吸光度值A作直线回归分析，求出回归方程ŷ=a+bx，并求出相关系数（r）和决定系数（r2）。（一）线性回归在两个具有相关关系的变量的一组数据（X与Y）间，通过散点图我们可观察出所有数据点都分布在一条直线附近，这样的直线可以画出许多条，而我们希望其中的一条能最好地反映X