《dna聚合酶简介》ppt课件

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1、Polymerization：从模板链的3‘末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐个将寡核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。dNTP进入结合位点后，聚合酶促进3‘-OH与5’-PO4结合生成磷酸二酯键，这一过程使酶的构象发生变化。DNAPolymeraseactivitiesDNApolymerasemovesalongtheoldstrandinthe3'-5'direction,creatinganewstrandhavinga5'-3'direction.StructureofhumanDNApolym

2、eraseStructureofhumanDNApolymerasecomplexedTTPwithmanganeseintheactivesite3′-5′exonucleaseactivity:proofreadingactivity:校正作用：新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3'-5'外切酶活性位点所识别并切除之。其功能是保证DNA复制的精确性。DNAPolymeraseactivities5′-3′exonucleaseactivity:切

3、除修复作用：从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上双链磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力达10倍以上。这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。Taq酶的5''-3''外切核酸酶活性只能在链延伸过程中降解遇到的双链DNA，例如，Taqman探针结合到DNA链上会被Taq酶切除。DNAPolymeraseactivitiesDNAPolymerasefamilies（human）familiesα:定位于胞核，参与复制引发，

4、不具5‘－3’外切酶活性familiesβ:定位于核内，参与修复，不具5'－3'外切酶活性familiesγ：定位于线粒体，参与线粒体复制，不具5‘－3’外切酶活性，有3‘－5’外切酶活性familiesδ：定位核，参与复制，具有3‘－5’外切酶活性，不具5‘－3’外切酶活性familiesε：定位于核，参与损伤修复（translesionsynthesis，TLS)，具有3‘－5’外切酶活性，不具5‘－3’外切酶活性商品化的DNApolymerase：主要是从嗜热古细菌中分离Taq酶：有5‘－3’外切酶活性，错配率取决于dNTP浓度，

5、可在3’末端加APfu:具有3‘－5’外切酶活性,高保真。人工体外构建体系成熟，可直接进行改造。MiguelGarcia-Diaz,CRCCritRevPlantSci.2007March;26(2):105–122.translesionsynthesis跨损伤修复：跨损伤修复(translesionsynthesis,TLS)是一类复制后修复;最先发现于原核细胞中。当DNA链在复制过程中遇到损伤而使复制停顿时;机体启动跨损伤修复系统以忽略存在的损伤;继续进行DNA复制。Priming效率：DNAPolymerase在引物3’-末端形

6、成酶/DNA复活体并开始DNA片段的延伸的过程称为Priming。提高其效率可使扩增特异性大幅提升。缺口平移（Nicktranslation）：DNA聚合酶活性和5‘→3’外切酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向前推进，即没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNApoI能从切口开始合成新的DNA链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。specificactionDNA聚合酶的改造方法：1.酶活性中心稳定化：通过定向结构修饰来提高酶活性中心区域的刚性

7、保持酶活性中心原有骨架基础上，提高其内部二级结构稳定性2.延伸因子和特异Priming：人工合成酶-延伸因子复活物，在复活物的前端加上特异的priming区域提升延伸性和反应速度，提高特异性的priming3.热启动抗体：通过制备酶抗体，形成抗原抗体复合物，使得酶在较高的温度得以释放发挥聚合活性，实现热启动PCR.是提高PCR灵敏度和特异性的重要方法之一.4.蛋白Sso7d的DNA结合域融合到DNA聚合酶中Sso7d蛋白为嗜热硫化裂片菌中的一种耐热的DNA结合蛋白，其对双链DNA有较强的亲和力，可识别PCR退火后的双链DNA，协助DNA

8、聚合酶快速识别延伸位点，增强了延伸速率，并使DNA聚合酶在DNA双链上移动速度加快，且能提高聚合酶对PCR抑制剂的抵抗能力。Sso7dEnzymeActivitydeterminationEnzymeUni