RT-PCR_步骤(精)

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1、一、组织抽提：1.      取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末2.      移入玻璃匀浆器加入1mlTrizol抽打匀浆3.      移入1.5ml新离心管用5ml针头抽打4.      冰上5分钟5.      离心12,000g4℃5分钟取上清液移入1.5ml新离心管6.      加0.2ml氯仿，震荡，冰上5分钟7.      离心<12,000g4℃10分钟取上层液相移入1.5ml新离心管8.      加0.5ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9.      离心<12,000g4℃5分钟弃去上清液

2、10.  加入1ml75%乙醇，震荡11.  离心<7,500g4℃5分钟弃去上清液12.  室温下使之变透明13.  加入DEPC处理水10μl--35μl溶解RNA（可保存在液氮或低温冰箱）14.  走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度二、RT反应体系（第一步）：约20分钟RNA抽提物5μlRadome引物2μlRNAsin0.5μl1.      65℃15分钟2.      立即放入冰浴RT反应体系（第二步）：约2小时RNAsin0.5μl10mMdNTP1μl

3、5×RT缓冲液4μl25mMMgCl24μlAMV逆转录酶3μl1.      37℃1.5小时2.      94℃5-10分钟3.      反应物保存于-20℃或进行PCR三1、PCR反应体系：约4.5小时25mMMgCl22μl10×PCR缓冲液5μl10mMdNTP1μl上下游引物10pmol/μl2.5μl×2CDNA模板2.5μlddH2O34μlTaq酶0.5μl轻质石蜡油50μl100μl1.      94℃2分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为第一个步1个循环2.      94℃45秒，55℃40秒，72

4、℃1分钟为第二步30个循环3.      72℃10分钟4.      取出后4℃5分钟后-20℃保存或走电泳三2、PCR反应体系：约5小时25mMMgCl23μl10×PCR缓冲液5μl10mMdNTP1μl上下游引物10pmol/μl2.5μl×2CDNA模板5μlddH2O30μlTaq酶1μl轻质石蜡油50μl100μl1.      94℃2分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为第一个步1个循环2.      94℃45秒，50℃40秒，72℃1分钟为第二步40个循环3.      72℃10分钟4.      取出后4

5、℃5分钟后-20℃保存或走电泳四、电泳：约1.25小时1.      配0.5×TBE电泳缓冲液300ml2.      胶浓度1.7%（40ml0.5×TBE加0.68g胶）3.      微波炉中火2分钟溶解胶4.      冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0.5μg/ml）5.      放入梳子，浇板，待凝固6.      加8μlPCR反应产物+2μl溴酚兰7. 电泳50-80V（每㎝5V）一、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1ml、200μl、

6、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20μl10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2卷16、三

7、角烧瓶：带盖，稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静

8、置4小时备用。2、75%乙醇：用无水乙醇DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris54g硼酸27.5g0.5MEDTA20ml？pH8.0蒸溜水1000ml5