体外受精与动物克隆技术

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1、第十三章体外受精与动物克隆技术第一节胚胎工程胚胎工程是在胚胎移植技术上发展起来的现代生物技术，在畜牧业生产和临床上具有广泛的应用，它主要包括体外受精技术、胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎冷冻保存技术和性别控制技术等。近30年来，随着生物技术的发展，胚胎工程技术也日新月异，在促进畜牧业发展及其相关领域研究中取得了令人瞩目的成就。一、体外受精体外受精(InVitroFertilization，IVF)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，它的基本原理是在人工模拟体内环境，包括营养、温度、湿度、气体、渗透压、pH等），使卵丘卵母细胞复合体中的初级卵母细

2、胞成熟，同时使精子获能，完成受精。1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体兔的输卵管中，其中4只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。试管小鼠(Whit-tingham，1968)大鼠(Toyoda和Chang，1974)婴儿(Steptoe和Edwards，1978)牛(Brackett等，1982)山羊(Hamda，1985)绵羊

3、(Hanada，1985)猪(Chang等，1986)牛（Parrish等，1986）体外受精技术主要包括以下几个主要方面：精子的采集与获能、卵子的回收及成熟培养、体外受精、受精卵的体外发育及试管胚胎的移植等。1.精子的获能处理张明觉Austin1951年发现兔子和大白鼠直接排出的精子不能使卵受精，必须在生殖道中停留一段时间后才具备受精能力，这一现象称为精子的获能（capacitation）。精子的获能过程是多时期、多步骤的复杂变化过程，包括两个阶段，获能的第一阶段是脱出精子表面的抗原物质和去能因子（DecapacitationFactors，DF），增强了膜通透性。第二阶

4、段是精子细胞膜蛋白变化，即发生顶体反应。2.卵母细胞的采集和成熟培养（1）卵母细胞的采集①超数排卵②从活体卵巢中采集卵母细胞③从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞（2）卵母细胞的选择（3）卵母细胞的成熟培养3.体外受精（1）常规体外受精技术将获能精子与成熟卵子置于受精液中共同培养，使之完成受精过程。通常情况下，受精液与获能液为同一种液体。（2）与分离精子相结合的体外受精技术将精子分离技术与体外受精技术结合起来生产预选性别的优良胚胎,对加速家畜品种改良和畜牧业生产具有重要的应用价值。（3）显微受精技术为了提高体外受精的成功率，借助显微操作仪将精子直接注入卵母细胞质或透明带下，完成受

5、精过程。显微受精技术避免了由透明带或卵质膜所形成的受精障碍，使受精率和准确率大大提高。4.受精卵的体外培养受精卵需要在培养液或输卵管中发育到桑葚胚或囊胚阶段，移植到受体后才能获得较高的妊娠率。但体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，往往会停滞在某一阶段不再发育，此现象称之为“发育阻滞”。不同动物体外发育阻滞出现的时期不同，小鼠为2细胞期，大鼠为8细胞期，牛和绵羊为8~16细胞，猪为4细胞期。目前，克服阻滞现象主要采用以下两个方法：一是改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足早期胚胎发育所需物质，确定并减除对其发育不利的成分；二是利用体细胞共同培养体系，以提供发育所需的物质条件，

6、目前广泛采用的有输卵管上皮细胞共培养体和颗粒细胞单层共培养体系。5.体外受精的意义家畜体外受精技术经过近20年的发展，已取得很大进步，为实现动物胚胎的工厂化生产提供了可能，对充分发挥良种母畜的繁殖潜力，加快家畜品种改良和优良品种遗传资源的开发与利用,加速畜牧业的发展具有重要的科学意义和实用价值。二、胚胎移植技术所谓胚胎移植（embryotransfer）也称受精卵移植，是指将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术，所以也称为“借腹怀胎”。1．供体、受体的选择胚胎移植的供体一般是选择需要加

7、速繁殖的有较大生产应用价值的健康的优良畜种，受体则是繁殖能力较强的健康本地品种。2．超数排卵用前面所述的超数排卵技术，在母牛发情期（发情期当天为零天）的第九天开始肌肉注射FSH，以递减剂量连续注射4天，每天注射两次（间隔12h），总剂量为300~400U；第三天的上下午，在注射FSH的同时肌肉注射氯前列烯醇（PGF2α的类似物）各两支（0.2mg/支）。3．同步发情同期发情又称同步发情，就是利用某些激素制剂人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。4．人工受精激素注射结束后，观察到发情后１２