体外受精与核移植动物

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1、第13章体外受精与核移植动物本节主要内容13-1体外受精动物（试管动物、试管婴儿）13-2核移植动物（克隆动物）13-1体外受精动物一定义体外受精(Invitrofertilization，IVF)是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。体外受精动物也称试管动物（test-tubeanimal），是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。例如：“世界山羊之王”波尔山羊体格高大，四肢粗壮，身体丰满。平均日增重350克，屠宰出肉率可达60%以上

2、。具有适应性强、采食性广、繁殖性能好、肉用性十分显著等特点。二优点（1）发挥优良母畜的繁殖潜力：一头优良品种母牛的卵巢内有几万个生殖细胞，但在一个正常性周期内只有几个卵泡同时发育，最后一个卵泡成熟并排卵。一只良种母畜一生大约只能繁殖10个左右的后代，大部分时间用于妊娠和哺乳。试管动物繁殖技术能够充分利用母体生殖潜力。（2）促进家畜改良的速度：繁殖能力的提高促进家畜改良速度，加速育种过程。（3）保存遗传资源：对优良或稀有哺乳动物建立“胚胎库”，进行受精卵或胚胎的长期保存。三试管动物培育流程（1）精子采集与体外获能、卵子采集与成

3、熟培养（2）体外受精（3）重组胚激活与体外培养（4）胚胎移植(Embryotransfer，ET)：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术（5）体内发育、出生1精子采集与体外获能采集：精子上游法采集，在精液上面加入少量培养液，有活力的精子游到表面，收集。精子获能(Capacitation)是指精子获得穿透卵子透明带能力的过程。精子的顶体反应：遇到卵子时，精子头部“顶体”脱落，顶体酶释放，使卵子的放射冠和透明带溶解，精子进入卵细胞，达到受精的目的。体内获能雄性精液

4、中含有“去能因子”（多是：糖蛋白），附在精子表面，是顶体酶的抑制剂，抑制了精子的受精能力。去能因子的清除，使精子顶体酶活性恢复，具有受精能力：主要依靠宫颈、子宫及输卵管液中的β淀粉酶、胰蛋白酶、β葡糖苷酶及唾液酸酶，后者在卵泡液中含量也很高，可以水解糖蛋白等“去能因子”。体外获能精子由最初在同种或异种雌性生殖道孵育获能，发展到用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获能，最后用化学成分明确的溶液培养获能。牛、羊的精子常用化学药物诱导获能，诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体。1986年Parrish等用含肝素的介质处

5、理牛的冷冻精液，然后与体外成熟的卵母细胞体外受精获得成功。2卵子的回收与成熟培养(1)超数排卵：雌性动物用孕酮、促卵泡激素和促黄体素处理后，从输卵管中冲取成熟卵子，可直接与获能精子受精。(2)从活体卵巢中采集卵母细胞：借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。成熟卵子的收集卵母细胞体外成熟培养未成熟卵母细胞（初级卵母细胞、次级卵母细胞要经过成熟培养使卵细胞成熟。家畜卵母细胞成熟培养液普遍采用TCM199培养基添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。血清是大分子营养物质的主要来源，而且可提供细胞

6、生长因子。作为能量来源的物质主要是葡萄糖，氨基酸也可作为能源起作用。卵母细胞的体外培养还需对温度、渗透压、pH、气相等进行控制。卵母细胞体外培养：通常采用微滴培养法，微滴体积一般为50-200微升，每个微滴中一般放入10-40个卵母细胞。二氧化碳培养箱培养，条件为39℃、100%湿度、5%二氧化碳。成熟选择标志：极体排出、透明带软化、卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，用DNA特意性染料染色后，在显微镜下进行核相观察，可见卵母细胞处于第2次成熟分裂中期。3试管动物的体外受精精子发生顶体反应时，精

7、子顶体外膜与其相贴的卵细胞膜发生多点融合而破裂，继而出现小孔。顶体酶就是通过这些小孔释放出去，使卵细胞周围的卵丘细胞分散并去除放射冠，分解透明带。精子顶体内膜与卵细胞膜相互融合，最终雄性原核和雌性原核合二为一，完成受精过程。一般将成熟的卵母细胞和获能的精子在一个合适的体外环境条件下共同培养一段时间，就能完成体外受精。受精过程所采用的培养液与动物细胞培养用培养液类似，但需添加一些特殊物质，如肾上腺素、亚牛黄酸、肝素等，它们有助于精子穿卵和促使原核的形成。精子和卵子常在小滴中共培养，受精时精子密度为1-9×106/ml，每10微

8、升精液中放人1-2枚卵子，小滴体积一般为50-200微升。受精成功观察：将含有受精卵的培养皿放置于倒置显微镜下，卵细胞内出现两个雌雄原核，标志着受精成功。（1）共同培养法（2）显微受精技术是通过人为方法使精子和卵子完成受精过程，由于一般都需要借助显微操作仪来完成，所以又称显微授精为辅助受精