细胞传代冻存复苏步骤

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1、准备工作：1、进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台，接着紫外灭菌30-50min，过后，关闭紫外灯，通风10min。2、从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基开紫外时即将当天实验所用物品拿出，室温放置一段时间注意事项：1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。开始工作：1、实验前换衣帽，开风淋，吹风。2、75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。4、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。5、取移液管一支，塞棉花端

2、，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。6、用移液管加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。7、用移液管（微量枪）吸取适量胰酶约2ml（所用胰酶的量），弃掉枪头。8、将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min，目的：提高酶活性，促进消化。9、取待用细胞，取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。10、用移液管加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞，将瓶底粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中，封口，标签。11、离心5min，1000转/min。以下分别介绍：一换液1、取待用的细胞，旋紧瓶盖。2、弃去

3、旧的培养液，把培养瓶放回原处。3、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。4、用移液管加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。5、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。6、用移液管加入适量的细胞培养液于培养瓶中。7、将细胞置于5%CO2、37度培养箱培养。二传代1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液，吸取已配制的培养基适量，加入离心管中，将细胞重悬、吹匀。2、取4-6滴细胞悬液到新的培养瓶中，培养瓶中应先加好适量细胞培养液，吹散细胞，镜下观察，细胞密度适宜则置入5%CO2、

4、37度细胞培养箱中。三冻存1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。2、按胎牛血清：DMSO=9:1的比例配制冻存液，装入青霉素瓶中。3、用移液管将冻存液平均加入离心管中，混匀离心管中细胞冻存液。4、用移液管将含细胞的冻存液移入冻存管中，封口，标签。5、冻存，需缓慢冻存，先放置4度冰箱1小时，然后放置-20度冰箱2小时，再置于-80度冰箱过夜，最后置于液氮灌中保存。四种板1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。2、取培养瓶及小烧杯各一只，摆放好。3、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。4、先移取2m

5、l，5ml，20ml完全培养液,分别加入到离心管，培养瓶，小烧杯中。5、混匀离心管中含完全培养液的细胞，再从离心管中取适量细胞悬液移入培养瓶，吹散细胞。镜下观察，细胞密度适宜则置入5%CO2、37度细胞培养箱中。（细胞传代目的）6、取细胞计数板，盖玻片酒精擦拭，均在酒精灯上烤一下，用微量枪从小烧杯中取出细胞悬液（约10μl），弃掉枪头，滴入盖玻片下（不能有气泡，不然会影响细胞计数），镜下观察细胞数（每个象限5个细胞，总和20个细胞，5×104个），不断调整小烧杯中细胞悬液的细胞浓度，直至镜下观察细胞数目符合要求。7、取1个96孔板，用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周，

6、孔板盖在酒精灯上烤一下。8、用微量枪从小烧杯中取出细胞悬液（约100μl），依次滴入96孔板中（枪头至孔下1/3处），同时用移液枪吸取完全培养液（约100μl）作为对照或调零，边缘孔用无菌PBS填充。9、滴完后，仍用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周。10、将96孔板置于5%CO2、37度细胞培养箱中进行培养。五MTT实验1、接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl。2、称取3mgMTT粉末，加6ml完全培养液，配制成浓度5%的MTT溶液，0.22μm的微孔滤膜除菌。3、培养细胞：同一般培养

7、条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。4、培养3－5天后，取出96孔板，用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周，孔板盖在酒精灯上烤一下。5、用（120μl）移液枪小心吸弃孔内培养上清液（包括调零孔内的培养上清液），弃去枪头。再用移液枪按每孔100μl加MTT溶液也包括调零孔，但边缘孔除外（枪头在孔上1/3处）。6、呈色：继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μlDMSO，置摇床上振荡10分钟，使结晶物充分融解。7、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果