细胞冻存与复苏 步骤.doc

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1、细胞冻存一、实验用品：二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25%含EDTA的胰蛋白酶、移液器、枪头、玻璃离心管、冻存管二、实验方法1、配细胞冻存液（培养液+保护剂）：DMEM培养基：胎牛血清：DMSO=7:2:1，配成1ml2、过程（1）对数生长期细胞，弃去旧培养液；（2）PBS洗清2-3次细胞（3）0.25%含EDTA胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清液；（4）加入冻存液，轻轻吹吸均匀（5）按每管1.0ml的量，分装入冻存管，拧紧管盖；（6）在冻存管上做标记，包括细胞代号及冻存日期；（7）分级冷冻

2、：4℃冰箱内30-40min，转入-20℃冰箱60min，放入-80℃冰箱，将冻存管放入-196℃液氮罐中保存。细胞复苏一、实验用品离心管、培养瓶、尖吸管、无菌试管，胎牛血清，DMEM培养基、大镊子、无菌纱布、二、细胞复苏1、准备工作：（1）将恒温水浴箱中的水温调至37℃（2）离心管、培养瓶，瓶口均过火（3）尖吸管，过火处理后插入无菌试管中（4）配培养液，放入超净台，瓶口过火，盖拧松，待用。2、复苏和培养：迅速取出冻存管（1）大镊子夹其盖部，在37℃温水中快速摇动，待有残留小冰核时，快速用含有消毒水的纱布擦拭，放入超净台（2）冻存管迅速过火开盖，手持无菌尖

3、吸管将其底部的细胞轻轻吹打起来，转移至刻度离心管中，用过的尖吸管插回原试管中（3）培养瓶盖子打开过火，用另一尖吸管往离心管中加入培养液，拧上盖子，过火（4）1000r/min离心5min（5）离心管管口过火，拧开，过火，液体倒入废液缸，再过火，加入适度含20%的FBS的DMEM新鲜培养液，轻轻吹打离心管底部的细胞，随后将其转移至培养瓶中（6）观察细胞状态，放入5%CO2培养箱中培养（7）（1）（2）