中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达

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1、中国人肥胖基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达资料来源：中华内分泌代谢杂志1998年第4期第14卷临床研究作者：周炜　缪为民　周丙荣　王立明　陈志辉　焦炳华单位：200433第二军医大学微生物学教研室；复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室肥胖基因概述及发现肥胖基因(Obesegene)是近几年克隆的一个新基因,该基因产物———瘦蛋白(leptin)，是由脂肪组织产生并分泌167个氨基酸组成的多肽,分泌蛋白分子量约16kb,是反映体内脂肪组成及体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子1783年Lavoisier和Laplace研究表明能量平

2、衡受生理调节。1950年发现了第一个隐性基因突变，命名为肥胖基因(Obesegene），它是一个单基因突变，导致重度肥胖和2型糖尿病，但其研究一直进展甚微。动物试验表明将肥胖鼠和正常鼠血液循环相连，肥胖鼠体重有所下降，提示正常鼠体内有一种因子可控制过度肥胖，而肥胖鼠则因基因突变而使该因子表达减少或作用丧失。经过8年努力，Friedman实验组运用定位克隆(Positionalcloning)技术，分离得到小鼠的肥胖基因并得到人的同源序列，为揭开肥胖症之迷及肥胖症的诊治奠定了基础。瘦素作用于下丘脑，控制代谢、能耗和生殖系统，调节体内脂肪含量。实验

3、表明，重组的瘦素具有使肥胖小鼠代谢和体重正常化，恢复肥胖基因缺陷小鼠生育能力等活性，而无明显的副作用〔4，5〕。脂肪组织：取自男性中国人胃切除手术病人的正常大网膜，液氮冻存备用新鲜脂肪组织立即置于液氮冻存。取1克冻存的大网膜脂肪组织，剪成数小块，在总量为10ml的Trizol液中高速匀浆1分钟。将组织匀浆液吸入50ml离心管，于室温下静置5分钟，加入2ml氯仿，剧烈振摇混匀后，室温静置3分钟，然后11000g4℃离心15分钟，将上层无色水相吸入一新管，加入5ml异丙醇，室温孵育10分钟，然后11000g4℃离心10分钟，75%乙醇洗涤RNA沉淀

4、，7500g4℃离心5分钟，稍干燥后用400μl无RNase的双蒸水溶解。（冷冻-离心-保存）RNA抽提反转录PCR（PCR扩增）根据已报道的序列设计引物，即将编码成熟肽的第二个密码子CCC转变为大肠杆菌常见密码子CCG:P1：5’-AACGAATTCATGGTGCCCATCCAAAAAGTCCAA-3’P2：5’-TTTGGATCCTCAGCACCCAGGGCTGCGGTC-3’以提取的RNA与P2引物70℃共同孵育5分钟后置冰浴。第一链cDNA合成反应体系为200uAMV反转录酶，5μl5×缓冲液，1μlRNasin，2μgRNA，四种dN

5、TP(各250μmol/L)。100pmol/LP2引物，总体积25μl,37℃，1小时。取5μlcDNA产物进行PCR扩增，反应体系为5uTaq酶，5μl10×缓冲液，四种dNTP(各250μmol/L)，P1和P2引物各100pmol/L，总体积50μl,94℃5分钟后行PCR扩增，循环条件为94℃变性30秒，60℃复性30秒，72℃延伸1分钟，35循环后72℃延伸10分钟，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。肥胖基因的分子克隆及DNA顺序分析将肥胖基因的RT-PCR产物电泳纯化后行EcoRI和BamHI双酶切，与同样经EcoRI和BamHI

6、双酶切的pUC19质粒载体连接。连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，LB培养基培养过夜。以IPTG/X-Gal体系筛选白色菌落，碱法快速抽提质粒，酶切后电泳鉴定重组质粒。用ABI377荧光自动测序仪进行DNA顺序分析。肥胖基因的分子克隆及DNA顺序分析用测序载体pUC19顺利地对肥胖基因PCR产物进行了克隆。通过ABI377荧光自动化测序，证明其序列与报道的白种人完全一致。肥胖基因的原核表达用EcoRI和SalI将肥胖基因从pUC19载体上切下，克隆入六聚组氨酸融合表达载体pPROEXHTa质粒(图1)。pPROEXHTa重组质粒转化大肠杆菌

7、（E.coli）DH5α菌株并经酶切电泳鉴定。接种重组质粒的单菌落于3mlLB中，37℃振摇培养过夜，按1%比例转接至30mlLB中，37℃振摇培养3小时，使OD600约等于0.3～0.4，加入IPTG至终浓度为0.4mol/L，继续培养3小时，离心收集菌体，进行SDS-PAGE电泳。示意图将肥胖基因克隆入pPROEXHTa六聚组氨酸融合表达载体，获得表达的蛋白分子量为17.5Kd，表达量高达20%左右。用所得的瘦蛋白可以进一步研究瘦素作用机制及治疗肥胖症和糖尿病。最后结果特别说明在有些研究肥胖基因在大肠杆菌表达中，肥胖基因可在不同大肠杆菌、不

8、同oD600值、不同时间诱导等条件下表达，从而可以研究外源基因在大肠杆菌中的表达量的效率。实验中我们曾分别用随机引物和P2引物来进行RNA反转录，结果