医学遗传学琼脂糖凝胶电泳技术

《医学遗传学琼脂糖凝胶电泳技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、琼脂糖凝胶电泳技术目录定义1原则3操作步骤4注意事项52专业范围用琼脂糖凝胶作支持物的电泳法。借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离。是基因操作中常用的重要方法。Scope/Specialty琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。原则（一）用琼脂糖作支持介质。有“分子筛”和“电泳”的双重作用凝胶具网络结构，大分子物质在涌动时受到的阻力大带电颗粒的分离取决于净电荷的

2、性质,数量和分子大小DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动原则（二）蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适2%的琼脂糖作电泳支持物琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响1、DNA的分子大小及构型2、琼脂糖浓度3、DNA分子的构象4、电源电压5、嵌入染料的存在6、离子强度影响操作步骤threedivisions正确选择凝胶浓度Attention（一）0.5～2%之间，低浓度的进行大片段核酸电泳，高浓度的进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作，使用质量好的琼脂

3、糖。高浓度的胶会使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失。电泳的合适电压和温度电压不超过20V/cm，电泳温度低于30℃，巨大的DNA电泳，温度低于15℃。电泳时电压和温度过高，会导致条带模糊和DNA带不规则迁移。电压太大会导致小片段跑出胶出现缺带。Attention（二）适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移。.缓冲液的作用维持合适的pH；导电性；EDTA；Att

4、ention（三）TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生

5、成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。DNA样品的纯度和状态样品中含盐量太高和含杂质蛋白会导致条带模糊和缺失。乙醇沉淀可以去除多余的盐，酚可以去除蛋白。变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mMNaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。Attention（四）DNA的上样注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。

6、DNA分子量标准每次上样6ul.Attention（五）Marker的选择DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正对DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的。Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。Attention（六）凝胶的染色和观察实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。本实验采用GELRED荧光核酸染料稳定性与安全性都很高。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。Attention（

7、七）