琼脂糖电泳技术.ppt

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1、琼脂糖电泳技术琼脂糖电泳的用途判断扩增片断的大小回收扩增片断用于转印进行Southern印迹问题如何获得清晰的琼脂糖电泳照片呢？琼脂糖电泳结果的影响因素凝胶电泳液电压检测手段琼脂糖凝胶浓度的选择1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比。2、琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过20kb。3、不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度/%0.30.60.70.91.21.52.0线状DNA大小

2、/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1电泳缓冲液DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE,其中TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。电泳缓冲液比较缓冲液缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度复杂DNA混合物；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常用TPE琼脂糖

3、凝胶中DNA的检测凝胶中核酸染色方法：溴化乙锭(EB)染色法和SYBRGold染色法前者检测灵敏度低10ng，但价格便宜，常用后者检测灵敏度高20pg，但价格昂贵，不常用染料存在时，线状DNA电泳迁移率降低约15％在凝胶中没有EB时，DNA条带更为清晰，当需要知道DNA片断的准确大小时，可以在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色染色方法：将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中，室温下30-45min。染色完毕后通常不需要脱色。在检测小量DNA(<10ng)时，需要脱色，具体方法为将染色后的

4、凝胶浸入水中或1mmol/LMgSO4中，室温脱色20min电压琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。但对于小片断的DNA可以5-20V/cm电压电泳凝胶制备的注意事项1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢DNA的迁移，并可使临近孔泳带变斜）2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长3、EB含量要适当4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电

5、泳液，再熔化5、检查梳子6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度7、凝胶稍厚些，避免样品溢出电泳时间PCR产物，应该在24h之内电泳电泳时间不易过长，对于长片断影响不大，但对小片断DNA影响明显电泳期间，EB向阴极迁移，与DNA迁移方向相反，长时间电泳将导致凝胶中EB含量显著较少，小片断DNA检测发生困难电泳上样量中号梳子：8—10ul小号梳子：6—8ul上样注意事项：1、加样时应悬空2、加样尽可能快3、不必每一个样品用一个吸头4、上样量中DNA含量过高，容易产生“弯月亮”凝胶拍照曝光时间：6--

6、10s拍照尺寸的选取：选用大的尺寸拍摄可获得清晰的电泳图片一般拍摄两次才可以得到清晰的照片小结电泳图片的影响因素：凝胶，电泳液，EB，上样操作，拍照好的电泳图片不一定一次就可以获得