单克隆抗体的制备和应用

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1、单克隆抗体的制备和应用基础部免疫教研室金伯泉20世纪有关抗体的生理学和医学诺贝尔奖项获奖年代学者获奖成就1901E.A.Behring发现抗毒素，开创免疫血清疗法1908P.Ehrlich抗体生成的侧链学说E.Metchnikoff细胞吞噬作用1913C.Richet发现过敏现象1960F.M.Burnet抗体生成的克隆选择学说P.B.Medawar1972G.M.Edelman抗体的化学结构R.M.Porter1977R.S.Yalow创立放射免疫测定法1984G.KöhlerB细胞杂交瘤和单克隆抗体C.MilsteinN.Jerne免疫网络学说1987Ton

2、egawa抗体多样性的遗传学基础NielsK.JerneGeorgesJ.F.KöhlerCésarMilsteinB淋巴细胞杂交瘤技术是如何创立的应用SRBC为免疫原免疫小鼠为模型,观察抗体产生细胞的体细胞突变(Somaticmutation)Hybridomas:Themakingofarevolution.Science1982Vol205pp1073-1075Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodiesofpredefinedspecificity.Nature1975,256:495导致了在生命科学领

3、域中的一场革命克隆（Clone）又名无性繁殖系，指由一个祖先细胞经分化、增殖所产生的遗传性状完全相同的细胞群多克隆抗体（Polyclonalantibody,pAb）用包含多种抗原决定基的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体的总和，称为多克隆抗体单克隆抗体（MonoclonalAntibody,mAb）由一个杂交瘤细胞克隆所产生的，针对单一抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体单克隆抗体的优点单特异性和均一性无限供应用混合的抗原制备出识别一个抗原决定簇的抗体McAbPcAb杂交细胞（hybridcell）在外界某些条件干预下（如

4、PEG、电穿孔），当两个细胞紧密地接触的时候,其细胞膜可能发生融合，产生具有原来两个细胞染色体/基因的单个细胞，称为杂交细胞杂交瘤细胞（Hybridomas）若用一种肿瘤细胞与另一种体细胞（如淋巴细胞）融合，所形成的杂交细胞称为杂交瘤细胞，简称杂交瘤。其既具有肿瘤细胞无限增殖的能力，也具有淋巴细胞的一些特性B淋巴细胞杂交瘤骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合所产生的杂交瘤细胞B淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理B细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞抗原制备免疫动物骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备细胞融合杂交瘤细胞的选择培养杂交瘤细胞的筛选及克隆化单克隆抗体的鉴定单克隆抗体的制备单克隆抗体制备的主要

5、步骤一、抗原细胞、细菌和病毒等，一般具有较强的免疫原性，可不加佐剂。例如，直接腹腔注射1~2×107个细胞。颗粒性抗原：可溶性抗原的来源主要是天然纯化，或者用目的基因在原核或真核细胞内表达。可溶性抗原需与弗氏完全或不完全佐剂混匀，进行免疫。可溶性抗原：B淋巴细胞在目的抗原刺激下增殖、分化，形成能分泌特异性抗体的B淋巴细胞，有利于细胞融合形成分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。多次免疫可通过抗体亲和力成熟机制，使B细胞分泌高亲和力抗体，由此形成的杂交瘤往往可分泌高亲和力抗体，有更高的应用价值。二、免疫动物免疫目的：采用与骨髓瘤供体同一品系的动物免疫动物品系（脾细胞供体）和骨

6、髓瘤细胞在种系发生上距离越远则产生的杂交瘤越不稳定，获得的杂交瘤不能在该品系小鼠体内诱生腹水。动物的选择：动物对抗原刺激易产生免疫应答反应8~12周龄雌性小鼠（最常用BALB/c）第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐剂第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐剂第三次免疫：可溶性抗原加生理盐水小鼠背部皮下注射小鼠背部皮下注射4周后3周后小鼠腹腔注射10天后检测血清效价加强免疫：可溶性抗原加生理盐水小鼠腹腔注射细胞融合3天后免疫程序：脾（spleen）抗原脾（spleen）所选择的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物品系相同三、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备骨髓瘤细胞系的选择

7、要点：自身不产生免疫球蛋白的重链与轻链对氨基碟呤敏感与免疫脾细胞融合后产生稳定分泌Ig杂交瘤细胞饲养细胞的作用：小鼠腹腔巨噬细胞小鼠脾细胞饲养细胞（feedercell）：增加细胞密度，满足新生的杂交瘤细胞对细胞密度的要求吞噬清除死亡的细胞分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长饲养细胞的种类和制备方法：四、细胞融合融合前的准备工作准备HAT、HT培养液、融合剂PEG准备饲养细胞准备骨髓瘤细胞准备免疫脾细胞拉颈处死小鼠无菌操作取出脾脏清洗、研磨收集细胞离心洗涤细胞计数脾细胞的准备收集细胞离心洗涤活细胞计数调整细胞浓度骨髓瘤细胞的准备细胞融合骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例

8、混合1:1