单克隆抗体的制备和应用

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1、单克隆抗体的制备及应用西南大学目录1单克隆抗体的简介2单克隆抗体技术发展经历3单克隆抗体的制备4单克隆抗体的应用5展望单克隆抗体的简介1第一部分单克隆抗体的简介1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术。他们把可在体外培养和无限增殖的骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体的特点。这种杂交瘤，通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原

2、决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（mAbs），简称单抗。单克隆抗体技术的发展经历2第二部分鼠源性单克隆抗体嵌合性单克隆抗体人源化单克隆抗体全人源单克隆抗体鼠源性单克隆抗体是来源于鼠蛋白，因此对于人体而言是外来物从而易被抵抗。嵌合性单克隆抗体是指同时具有人和鼠的来源构成，通常是30%比70%。鼠源部分用来结合抗原，人源部分用来诱导产生疗效。人源化抗体就是指抗体的可变区部分或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。。单克隆抗体技术发展经

3、历单克隆抗体的制备3第三部分单克隆抗的制备动物免疫11234细胞融合和选择性培养杂交瘤细胞的筛选及克隆化大量制备及纯化单克隆抗体制备的简易流程动物免疫抗原制备：制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，同时应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。免疫动物的选择：一般的杂交瘤生产都选用BALB/c小鼠或LOU/c大鼠作为免疫

4、动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。免疫程序的确定：在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。目前常用的免疫程序细胞融合和选择性培养融合过程中，常采用聚乙二醇（PEG）作为融合诱导剂。PEG促进细胞融合的机制可能是与临近细胞膜的水分相结合使细胞间的水分被取代，降低细胞表面的极性，导致脂质双分子层不稳定，引起细胞膜的融合。注意：PEG的分子量和浓度与

5、融合效果相关，PEG的分子量越大，浓度越高，其促融率也越高，但其粘度和细胞的毒性也随之增大；浓度低于30％时，融合率低。HAT选择性培养1964年Littlefield首先发明了HAT(H—Hypoxanthine次黄嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T—Thymidine胸腺嘧啶核苷)选择性培养。HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的。细胞内DNA的生物合成途径主要生物合成途径补救途径甲氨喋呤次黄嘌呤次黄嘌呤核苷酸HGPRT+TK+胸腺嘧啶胸腺嘧啶脱氧核苷酸DNA利用糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA叶

6、酸拮抗物氨基蝶呤可阻断主要途径小鼠HGPRT-骨髓瘤细胞（Sp2/0）融合后的细胞在HAT选择培养基中结局Sp2/0+BSp2/0Sp2/0BBSp2/0B死亡死亡存活杂交瘤细胞的筛选及克隆化克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染mm11443322424442333244444222443333333333有限稀释法大量制备及纯化大量制

7、备纯化方法1、盐析2、凝胶过滤3、离子交换层析4、亲和层析法盐析：用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。血清｜50%饱和度硫酸胺上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）｜33%饱和度硫酸胺上清沉淀拟球蛋白r球蛋白凝胶过滤法：干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入。胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来

8、较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。交联葡聚糖凝胶(Sephadex）琼脂糖凝胶(Sepharose)离子交换层析法DEAE纤维素：结合溶液中带负电