黑曲霉发酵柠檬酸

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1、黑曲霉发酵生产柠檬酸（中北）生物技术18083108陈园园摘要：黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。黑曲霉从土壤中分离培养，土壤来源有要求。黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸，了解产物发酵生产的机理，柠檬酸发酵的发酵条件，掌握发酵过程步骤，了解产物提取的几种方法，学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理，掌握沉淀法提取柠檬酸的方法是

2、本次实验的目的要求。关键词：黑曲霉、黑根霉、柠檬酸实验材料和试剂：样品：新鲜土壤样品（来源于食堂垃圾堆处）培养基：查氏培养基、马铃薯培养基无菌水：带有玻璃珠装有20mL无菌水三角瓶试剂：400U/mL庆大霉素液、10％苯酚、酚酞指示剂、碳酸钙、0.1MNaOH、0.1MH2SO4实验器材：无菌培养皿、培养箱、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、圆底烧瓶、抽滤瓶、玻璃棒、抽滤设备、冰箱实验步骤一．黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养1.黑曲霉的分离培养①土壤样品的采集用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取

3、5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好灭菌容器内扎好。编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。②制平板：在融化好的查氏培养基中加入链霉素0.2mL/瓶制3块PDA培养基、3块查氏培养基平板。③制备土壤稀释液：1.称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，同时加入3滴10％苯酚溶液，振荡5min，即为稀释10－1的土壤悬液。2.另取无菌离心管2支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4，再加入0.9mL无菌水。取10－1的土壤稀释液，吸取0.1mL

4、加入第一只离心管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－3、10－4土壤稀释液。无菌操作法分别吸取10－2、10－3、10－4土壤稀释液0.1mL，分别加在已制好的3块查氏平板培养基上。④涂板用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，静置于桌面5min。2.黑根霉的分离培养马铃薯培养基2块1号马铃薯培养基用接种环无菌操作从酒酿样品中挑取1环在上面进行划线分离，2号马铃薯培养基取安琪菌剂0.1g加入10mL带玻璃珠的无菌水三角瓶进行稀释溶解，取稀释液0.1mL在上面进行均匀涂布。

5、将划好的培养基置于517房间30℃培养箱内正置培养3天，进行结果观察和转接。3.菌种检测和扩培培养72小时后，星期一过来，检查查氏培养基和划线马培，看是否有产酸的曲霉菌落，和典型的根霉菌落，并显微检测其是否为黑曲霉和黑根霉。确证后分别将其转接至剩余的两块PDA平板培养基上扩增培养和保藏。二．黑曲霉发酵柠檬酸1.种子液制备菌种获得（纯种），无菌操作，取5mL无菌水至黑曲霉平板上，用接种环轻轻刮下孢子，用枪吹吸数下制成孢子悬液。2.液体深层发酵无菌操作，取3mL孢子悬液接种于玉米粉摇瓶发酵培养基中。在转速为200rpm旋转摇床上，

6、30℃培养5～6天。三．柠檬酸的提取把发酵完成后的发酵液中的目的产物提取出来，并通过精制成为合格产品，该过程通常称为后提取，后提取是发酵工程不可缺少的部分。1、处理黑曲霉玉米粉发酵液：布氏漏斗垫上纱布抽滤除去菌体和残渣，量筒测量清液体积V0；2、滴定：量取5mL清液、5mL蒸馏水于锥形瓶中，再滴入2～3d酚酞指示剂，用0.1MNaOH溶液滴定，滴定终点为淡红色，30s内不褪色，记下消耗的NaOH溶液体积V1；M总酸（g）＝V1(mL)×0.1(mol/L)×0.001×1/3×210×V0/5M碳酸钙（g）＝M柠檬酸×（V0－

7、5）/V0×1/210×3/2×1003、钙盐沉淀：称取一定质量的碳酸钙粉末，边搅拌边缓慢地加入到剩余的清液中（防止产生大量的泡沫），85℃反应5min（使柠檬酸钙沉淀下来），趁热抽滤，并用沸水洗涤沉淀物2～3次（除去残糖、蛋白质等可溶性杂质）；4、酸解：VH2SO4（mL）＝M碳酸钙/100/0.1(mol/L)×1000在沉淀物中加入约两倍体积的蒸馏水，调匀成浆状，量取一定体积0.1MH2SO4溶液，边搅拌边加入到浆液中，85度反应10min，趁热抽滤，获得清亮的酸解液；5、低压浓缩：将酸解液转入圆底烧瓶中，水浴60～70

8、度，真空度0.08~0.09MPa，浓缩至原体积约1/10；6、冷却结晶：将浓缩液转入烧杯中，于室温下搅拌，待出现晶核，停止搅拌，再移入4度冰箱冷却结晶约15min，抽滤获得柠檬酸晶体，烘干后称重m柠檬酸。计算黑曲霉发酵柠檬酸的产率：M总酸（g）/V发酵液（mL）计算钙盐沉淀