细胞培养-正常组织细胞的培养

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1、正常组织细胞的培养病原学教研室申艳娜2主要内容培养细胞的取材组织材料的分离原代细胞培养几种细胞培养方法举例建立细胞系3主要内容培养细胞的取材组织材料的分离原代细胞培养几种细胞培养方法举例建立细胞系4培养细胞的取材取材的基本要求新鲜标本严格无菌操作尽可能减少对细胞的机械损伤尽量去除血液、剔除脂肪、结缔组织等同时保留组织学标本（光镜和电镜）培养细胞的取材基本器材和用品手术器械青霉素小瓶（含培基或缓冲液）小烧杯培养皿6培养细胞的取材皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血细胞取材骨髓、羊水、胸腹水内细胞的取材其他组织的取材培养细胞的取

2、材皮肤和粘膜的取材上皮细胞的来源方法似外科断层皮片手术面积一般2-3mm2，取材尽量薄可用高浓度抗生素漂洗人类角质形成细胞8培养细胞的取材内脏和实体瘤的取材常用的细胞培养材料内脏除肠道外多无菌实体瘤因破溃、感染可能伴有细菌9培养细胞的取材血细胞取材染色体分析淋巴细胞体外激活，进行免疫治疗骨髓、羊水、胸腹水内细胞的取材无需特别处理，离心后直接接种10主要内容培养细胞的取材组织材料的分离原代细胞培养几种细胞培养方法举例建立细胞系组织材料的分离机械法化学法组织材料的分离细胞悬液的分离低速离心500-1000rpm×10min13组

3、织材料的分离组织块的分离机械分散法机械分散法注射器针芯挤压不锈钢滤网剪切分离法14组织材料的分离组织块的分离机械分散法15组织材料的分离组织块的分离消化分离法胰蛋白酶适合胚胎、上皮、肝、肾等组织消化。pH、温度、酶蛋白浓度、组织块大小影响消化效果。浓度为0.1％～0.5％，pH8.0.与EDTA混合使用。16组织材料的分离组织块的分离消化分离法胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种类型。根据分离组织类型选择相应型的胶原酶。对胶原有较强的消化作用，适合消化纤维性组织、上皮和癌组织。浓度为0.03～0.3％。17主要内容培养细胞的取材组织

4、材料的分离原代细胞培养几种细胞培养方法举例建立细胞系18原代细胞培养原代培养定义：是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。优点：生物特性未发生很大变化，最接近和反映体内生长特性。原代细胞培养培养方法组织块法消化法20原代细胞培养可能遇到的问题完全无细胞游出或移动；有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代；有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡；21原代细胞培养可能遇到的问题传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。22原代细胞培养问题的解决方法加

5、入适宜底物把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。23原代细胞培养问题的解决方法加入生长因子应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。24主要内容培养细胞的取材组织材料的分离原代细胞培养几种细胞培养方法举例建立细胞系表皮细胞在人和动物体内，表皮细胞生长在胶原基质膜上，并从基质膜获取生长分化所需要的物质，因此体外培养培养需要使用某些基质、培养液及包括滋养层在内的一些添加物。几种细胞培养方法举例无菌切取

6、皮肤标本，用DBSS冲洗3～5遍。将标本的上皮层面朝下放入干燥的培养皿中，加数滴PBS使之湿润，用弯剪尽可能除净皮下脂肪和结缔组织，将标本切成大约1cmX2cm的小块。用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗标本至少3次，将标本放入胰蛋白酶溶液中或中性分散酶II中，4℃放置15-48h，或37℃1-3h。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例表皮层和真皮层分离时,表皮层为棕色，真皮层为白色，观察到表皮与真皮分离时将其一如到另一10cm塑料平皿，真皮向下，用5ml血清完全培养液冲洗，用弯镊轻轻将表皮剥脱，放入含20ml培养液的50

7、ml离心管中，反复吹打，过100目尼龙筛，使角化上皮细胞分离。滋养层细胞制备在已形成单层的3T3细胞培养瓶中加入丝裂霉素，使3T3细胞不在分裂增殖，即可作为表皮细胞的黏附滋养细胞。黏壁剂包被用0.01%的胶原蛋白铺于培养瓶的底部，过夜，弃上清，40℃烘干，制成胶原蛋白黏附膜，紫外线照射2h消毒备用。几种细胞培养方法举例29几种细胞培养方法举例脐静脉血管内皮细胞取健康产妇分娩正常新生儿后6小时以内的脐带，立即浸泡在含青霉素、链霉素的D-Hanks液中，洗去外部血污。在超静工作台上剪去有钳子夹痕、扭曲、凝血块、穿孔段后分离出10

8、-15厘米一段。30几种细胞培养方法举例脐静脉血管内皮细胞用注射器吸取Hanks液，充分清洗脐静脉，用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉管腔内缓慢注入0.1％I型胶原酶8-10ml，静脉充盈后，用另一只血管钳夹住防胶原酶返流。置入37℃培养箱内消化10分钟。以1～5X105个细胞的密度接