细胞融合与单克隆抗体1

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1、第三章细胞融合与单克隆抗体3.1细胞融合(cellfusion)定义:在离体条件下用人工的方法把不同种的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。3.1.1细胞融合的发展历史“自发”细胞融合现象：1838年Muller多核的肿瘤细胞1858年Virchow正常组织、发炎组织及肿瘤组织——多核细胞1873年Luginbuhl天花病人——多核体血细胞1875年Lange蛙类血液细胞发生合并3.1细胞融合(cellfusion)3.1细胞融合(cellfusion)3.1细胞融合(cellfusion)重要事件1962年,(日)冈田善雄仙台病毒促细胞融合70年代,(华裔加籍)

2、高国楠PEG促植物原生质体的融合80年代，电融合3.1细胞融合(cellfusion)植物细胞融合：1972年（美）P.S.Carlson——杂种烟草现代植物细胞融合的开始1978年（德）梅歇尔斯——“pomoto”3.1细胞融合(cellfusion)“Pomoto”3.1细胞融合(cellfusion)3.1.2植物原生质体培养与细胞融合(ProtoplastandCellfusion)植物原生质体培养植物细胞融合3.1细胞融合(cellfusion)3.1.3动物细胞融合动物细胞融合是研究细胞遗传信息转移，基因在染色体上的定位以及创造新细胞株的有效途径。3.1细胞

3、融合(cellfusion)肿瘤细胞与树突状细胞的融合3.1细胞融合(cellfusion)人纤维肉瘤细胞与小鼠畸胎瘤细胞融合1978年(瑞士)埃勒门斯(美国)柯路斯3.1细胞融合(cellfusion)3.1细胞融合(cellfusion)3.1.4细胞融合的诱导诱导融合的方法:物理法:电场刺激激光显微操作化学法:聚乙二醇(PEG)结合高pH、高钙离子法生物法:仙台病毒3.1细胞融合(cellfusion)不同细胞融合的条件及其主要应用来源前处理融合方法主要应用动物细胞不需仙台病毒、PEG、电融合生产单克隆抗体植物细胞脱壁PEG、电融合创造植物新品种微生物细胞脱壁PE

4、G高产优质新菌种3.1细胞融合(cellfusion)仙台病毒诱导仙台病毒(Sendalvirus)也称日本血凝病毒HVJ，属粘病毒副流感类群，是RNA病毒，多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。3.1细胞融合(cellfusion)融合的可能机制：病毒被膜含有糖蛋白，其表面还分布有许多具有神经氨酸酶和凝血活性的突起，神经氨酸酶可降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集，再通过膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中的脂类分子重排，而打开质膜，导致细胞融合。3.1细胞融合(cellfusion)融合过程：1.病毒颗粒附着细胞膜上起搭桥作用，使细胞粘着成堆，在4℃冰浴中细胞紧密靠近，但不发生

5、融合。2.37℃温浴后，粘结部位的细胞膜破坏，形成通道，细胞质流通、融汇。3.病毒颗粒进入细胞质，此时两个细胞合并、变圆，完成融合，全过程约15～30分钟。4.细胞核也相互合并,完成细胞融合3.1细胞融合(cellfusion)3.1细胞融合(cellfusion)PEG诱导PEG——聚乙二醇(polyethyleneglycol)商品名：卡波蜡(carbowax)多聚化合物，分子式H(OCH2·CH2)nOH实验室用PEG平均分子量在200－20,000一般：<1,000——液体>1,000——固体常用分子量：4000—60003.1细胞融合(cellfusion)融

6、合的可能机制？脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生变化？改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋白质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之故。？3.1细胞融合(cellfusion)初步分析可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间，在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH、高钙离子溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。3.1细胞融合(cellfusion)PEG诱导过程注意事项：控制与分子量、浓度和处理时间悬浮法：将细胞悬于

7、40～50％的PEG4000进行溶，处理1～2分钟为宜。离心法：先将细胞混合物悬于30～40％的PEG4000，再离心进行融合，则可适当延长融合时间，以5～8分钟为宜。3.1细胞融合(cellfusion)PEG诱导注意事项：pH值以pH7.4～8.0为宜，或略偏碱性pH8.0～8.2。辅以5～15％的DMSO或在融合前用PHA处理一下，效果更好。3.1细胞融合(cellfusion)PEG融合法优点效率高材料方便，操作简易效果稳定PEG融合法缺点对细胞有毒性3.1细胞融合(cellfusion)3.1细胞融合(cellfusion)物理