GBT19438.3-2004 H7亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测方法.pdf

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1、ICS11.220一一B4’药羚中华人民共和国国家标准GB/T19438.3-2004H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法Methodofreal-timeRT-PCRforthedetectionoftheavianinfluenzavirussubtypeH7www.bzfxw.com2004-02-14发布2004-02-15实施率督斜臀瓣臀澄臀暴发布GB/T19438.3---2004前言GB/T19438-2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分：—GB/T19438.1-2004禽流感病毒

2、通用荧光RT-PCR检测方法》；—GB/T19438.2-2004KH5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；—GB/T19438.3-2004KH7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；—GB/T19438.4-2004((H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。本部分的附录A为资料性附录。本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。本部分主要起草人：高志强、张鹤晓、郭晋优、刘继红、吴丹。www.bzfxw.comGB/T

3、19438.3-2004H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法1范围本部分规定了荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的操作方法。本部分适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法3缩略语

4、下列缩略语适用于本部分。3.1荧光RT-PCR荧光反转录一聚合酶链式反应。3.2Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的闭值时所经历的循环数。3.3RNA核糖核酸。3.4Taq酶TaqDNA聚合酶。3.5PBS磷酸盐缓冲盐www.bzfxw.com水。3.6DEPC焦碳酸乙二醋。4原理采用TagMan方法，通过比对禽流感病毒血凝素基因，设计一对仅在H7亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（R),3`端标记的TAMRA荧光

5、素（Q）在近距离内能吸收5‘端荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。反应在退火时，引物和探针同时与目的基因片段结合，GB/T19438.3-2004探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5'-3‘的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5试剂和材料5.1试剂除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均须使用无RNA酶的容器（用D

6、EPC水处理后高压灭菌）进行分装。5.1.1H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒”：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录Ao5.1.2三氯甲烷。5.1.3异丙醇。5.1.475％乙醇，用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制。5.1.50.01mol/L(pH7.2）的PBS：配方见GB/T19438.1-2004中附录Ao121C士2*C,15min高压灭菌后，无菌条件下按10000IU/mL加人青霉素和链霉素。5.2仪器设备5.2.1高速台式冷冻离心机：要求最大离心力在12000r/min以上。5.2.2荧光PCR

7、仪。5.2.3计算机。5.2.42'C-8℃冰箱。5.2.5一20℃冰箱。5.2.6微量加样器：0.5ftL-10fiL;5pL-20pL;20N.L^-200fiL;200IAL-1000p.La5.2.7混匀器。5.2.8可移动紫外灯：要求近工作台面。6样品的采集与前处理采样过程中样本间不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。6.1取样工具需要下列取样工具：—棉拭子；—剪刀、镊子；—Eppendorf管；—研钵。www.bzfxw.com以上取样工具必须经121℃士2'C,15min高压灭菌并烘干。6.2采样方法

8、6.2.1活禽样品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法为：一一对于咽喉拭子，采取时要深人喉头及上额裂来回刮3次～5次取咽喉分泌液；—取泄殖腔拭子时，将拭子深人泻殖腔转一圈沾取粪便；1)由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果