GBT 19438.2-2004 H5亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测方法

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1、ICS11.220一一B‘’药黔中华人民共和国国家标准GB/T19438.2-2004H5亚型禽流感病毒荧光RTPCR检测方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofavianinfluenzavirussubtypeH52004-02-14发布2004-02-15实施率替冒瞥臀瓣瞥篷臀臀暴发“GB/T19438.2-2004前言GB/T19438-2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分：—GB/T19438.1-2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》；—GB/T19438.2-2004((H

2、5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；—GB/T19438.3-2004t(H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》；—GB/T19438.4-2004((H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。本部分的附录A是资料性附录。本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。本部分主要起草人：刘环、张鹤晓、赖平安、周琦、刘宁。GB/T19438.2-2004H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法1范围本部分规定了H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR操作方法。本部分适用于活禽

3、及其产品中H5亚型禽流感病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法3缩略语下列缩略语适用于本部分。3.1荧光RT-PCR荧光反转录一聚合酶链反应。3.2Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阂值时所经历的循环数。3.3RNA核糖核酸。3.4Taq酶TaqDNA聚合酶。3

4、.5PBS磷酸盐缓冲生理盐水。3.6DEPC焦碳酸乙二醋。4原理采用TagMan方法，在比对禽流感病毒血凝素基因的基础上，设计一对仅在H5亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示）,3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5‘端荧光基团发出的荧光信号。反应进人退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5'-3’的外切核

5、酸酶功能，将探针降解。这样探针上的GB/T19438.2-2004R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。5试荆和材料5.1试剂除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器（用DEPC水处理后高压灭菌）分装。5.1.1三氯甲烷。5.1.2异丙醇：一20℃预冷。5.1.375％乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-200C预冷。5.1.40.01mol/L(pH7.2）的PBS：配方见GB/T19438.1-2004中

6、附录A,121C士2C,15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、链霉素各10000IU/mL,5.1.5H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒1)：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录A,5.2仪器设备5.2.1高速台式冷冻离心机：最大离心力12000r/min以上。5.2.2荧光PCR检测仪、计算机。5.2.32C-4℃冰箱和一20℃冰箱。5.2.4微量加样器：0.5pL-10pL,5pL-20IAL,20pl,-200fAL,200tiL^-1000pLa5.2.5组织匀浆器。5.2.6混匀器。5.2.7可移动紫外灯。6样品的采集与前处理采样过程中样本

7、不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。6.1取样工具下列取样工具必须经121℃士20C,15min高压灭菌或经160℃士2℃干烤2h,—拭子；—剪、镊；—研钵；—Eppendorf管(1.5mL)。6.2采样方法6.2.1活禽样品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，具体采集方法如下：—咽喉拭子，采取时要将拭子深人喉头及上愕裂来回刮3次～5次，取咽喉分泌液；—取泄殖腔拭子时，将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便；—将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放人盛有1.0mLPBS的Eppendorf管中，编号备用。6.2.2内脏或肌肉样